GB∕T 38421-2019 毛皮 源性成分检测 实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法.pdf

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1、犐犆犛５９．１４０．３０犢４６!"#$%&''()*犌犅／犜３８４２１—２０１９!"#$%&'()*+,-$./01234（犘犆犚）'(56犉狌狉—犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犪狀犻犿犪犾犱犲狉犻狏犲犱犿犪狋犲狉犻犪犾—犙狌犪犾犻狋犪狋犻狏犲狉犲犪犾狋犻犿犲狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀（犘犆犚）犿犲狋犺狅犱狊２０１９１２３１78２０２００７０１)9'(+,-./01278'()*3/0456犌犅／犜３８４２１—２０１９前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由中国轻工业联合会提出。本标准由全国皮革工业标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ

2、２５２）归口。本标准起草单位：广州检验检测认证集团有限公司、国家皮革质量监督检验中心（浙江）、深圳华大基因科技服务有限公司、浙江方圆检测集团股份有限公司、中国皮革制鞋研究院有限公司、陕西科技大学、中国计量大学、东莞市惟思德科技发展有限公司。本标准主要起草人：覃芳芳、黄新霞、孙海陆、陈宗良、王学川、冯爱明、张弛、孙霞、赵洋、章文福。Ⅰ犌犅／犜３８４２１—２０１９毛皮源性成分检测实时荧光定性聚合酶链式反应（犘犆犚）检测方法１范围本标准规定了天然毛皮中动物源性成分定性分析的实时荧光ＰＣＲ检测方法。本标准适用于八种天然毛皮（水貂、兔、貉子、浣熊、马、牛、山羊和绵羊）的源性成分定性

3、检测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１９４９５．２转基因产品检测实验室技术要求ＧＢ／Ｔ２１１０２—２００７动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法实时荧光ＰＣＲ方法ＧＢ／Ｔ２５１６５—２０１０明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光ＰＣＲ法３术语和定义、缩略语３．１术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１．１实时荧光聚合酶链式反应狉犲犪犾狋犻犿犲狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻

4、狀狉犲犪犮狋犻狅狀在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累，实时监控整个ＰＣＲ进程，并通过扩增曲线对未知模板进行定性分析的方法。注：改写ＧＢ／Ｔ１９４９５．４—２０１８，定义３．１．２。３．１．２犆狋值犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。［ＧＢ／Ｔ１９４９５．４—２０１８，定义３．１．５］３．２缩略语下列缩略语适用于本文件。ＤＮＡ：脱氧核糖核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）ＤＴＴ：二硫苏糖醇（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）ｄＮＴＰｓ：脱氧核苷三磷酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏ

5、ｓｐｈａｔｅ）ＦＡＭ：６羧基荧光素（６ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）Ｎａ２ＥＤＴＡ：乙二胺四乙酸钠盐（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄｄｉｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ）ＰＣＲ：聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）ＳＤＳ：十二烷基硫酸钠（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）１犌犅／犜３８４２１—２０１９ＴＡＭＲＡ：６羧基四甲基若丹明（６ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）犜犪狇酶：ＤＮＡ聚合酶（犜犪狇ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）Ｔｒｉｓ：三羟甲基氨基甲烷［（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ

6、ｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ］１８ＳｒＲＮＡ：真核生物核糖体小亚基１８Ｓ基因（１８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ）４原理提取动物毛皮试样中的ＤＮＡ，针对水貂、兔、貉子、浣熊、马、牛、山羊、绵羊物种特异性的内源基因序列设计引物，通过特异性引物和标记荧光物质探针，对动物源性的ＤＮＡ进行实时荧光ＰＣＲ扩增，根据ＰＣＲ扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定，实现对毛皮中动物源性成分的定性分析。５试剂和材料５．１一般规定：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规定。５．２灭菌水。５．３氢氧化钠（ＮａＯＨ）。５．４三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒ

7、ｉｓ）。５．５盐酸（ＨＣｌ）。５．６乙二胺四乙酸钠盐（Ｎａ２ＥＤＴＡ）。５．７十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）。５．８氯化钠。５．９乙酸钠。５．１０冰乙酸。５．１１蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ），－２０℃条件下保存。５．１２二硫苏糖醇（ＤＴＴ）。５．１３苯酚（Ｔｒｉｓ平衡酚，ｐＨ７．０～８．０）。５．１４三氯甲烷。５．１５异丙醇。５．１６无水乙醇。５．１７乙醇溶液（体积分数７５％）：取７５ｍＬ无水乙醇（５．１６），加水定容至１００ｍＬ。５．１８ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液（１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ＝７．６和ｐＨ＝８．０）：称取１２１．１ｇ三羟甲基氨基