实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定.ppt

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1、实验二、蛋白质的颜色反应及含量测定一、实验目的1.1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。1.2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。1.3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。1.4、学习考马斯亮蓝法、双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法二、实验重点难点2.1、双缩脲反应及茚三酮反应的实验原理2.2、对于双缩脲反应中碱和硫酸铜的添加顺序2.3、茚三酮反应中颜色变化过程2.4、测定蛋白质含量的实验原理、标准曲线制定三、实验原理3.1、概括蛋白质(Protein)是由许多不同的氨基酸，按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子。

2、氨基酸的基本结构为：蛋白质的主要连接方式为：不变部分可变部分3.2蛋白质与氨基酸的颜色反应总结反应名称反应基团反应操作反应产物及现象用途双缩脲反应肽键NaOH及CuSO41ml样+2ml0%NaOH+2dCuSO4Cu–Cu—双缩脲络合物（兰紫色）测蛋白质含量鉴定蛋白质水解是否完全茚三酮反应α-氨基酸0.5ml茚三酮试剂+1ml样兰紫色测AA含量检验AA及蛋白质黄色反应苯环、Try、Tyr1ml样+3~4d浓HNO3观察再加NaOH，再观察黄色硝醌酸生成鉴定Try、Tyr坂口反应胍基样1ml+5d15%NaOH+2d1%α-萘酚+6d次溴酸钠玫瑰红色产物生成鉴

3、定Arg测定Arg含量乙醛酸反应吲哚环样1ml+2ml冰乙酸+浓HSO4(沿壁且不能混匀)微热中间生成兰紫色环鉴定Try偶氮反应咪唑基样1ml+偶氮试剂与20%NaOH1ml有橙色和鲜红色产物生成鉴定His、Tyr醋酸铅反应巯基、CySCySH0.5%Pb(AC)2+10%NaOH+1ml样+加热后再加HCl闻其味黑色PbS生成臭鸡蛋味鉴定含硫AACyS、CySH3.3、双缩脲反应双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。在一定浓度范围内，反应后颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系。蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处

4、有最大光吸收。含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。含有一个肽键和一个—CS—NH2，—CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基团的物质也有此反应。NH3干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。双缩脲法测蛋白质浓度操作简便、迅速，蛋白质浓度与光密度的线性关系好，是蛋白质浓度分析的常用方法之一，但本法缺点是灵敏度低，蛋白质量须在1-20m

5、g/mL测定结果较准确。在需要快速、但准确性要求不高的测定中常用此法。3.4、茚三酮反应C2CHCCCOOHOH2CCOOHRCCCOOOHOH还原茚三酮茚三酮水合茚三酮ONH3RO++++HNH水合茚三酮茚三酮还原茚三酮篮紫色化合物茚三酮反应，即：所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含量，也可以在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或定量分析。在多肽合成中常用来检验有无自由氨基的肽类存在.β-丙氨酸、氨、许多一级胺呈正反应。在法医学上，使

6、用茚三酮反应可采集嫌疑犯在犯罪现场留下来的指纹。因为手汗中含有多种氨基酸，遇茚三酮后起显色反应。3.5、米伦氏反应（Millon反应）苯酚及某些二羟苯衍生物中加入米伦试剂(硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物)后产生白色沉淀，可能是羟苯之亚硝基衍生物，经变位作用变成颜色更深的邻醌肟，最终得具有稳定红色的产物。含有酚基的化合物都有这个反应，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都能与米伦试剂反应。（溶液中不能含有大量无机盐、H2O2、醇或碱，因它们能使汞变成沉淀，中和碱时不能用HCl）3.6、黄色反应含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，

7、该化合物在碱性溶液中进一步形成橘黄色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。例如皮肤、指甲、毛发等遇浓硝酸变黄。3.7常用测定蛋白质浓度的方法凯氏定氮法：样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使硫酸铵分解出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据酸液被中和的程度计算含氮量。*6.25得蛋白质量双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓

8、度。Folin-酚试剂法（lowry法