ELISA实验基础知识培训.ppt

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1、ELISA实验基础知识培训2016.1.21.酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理及概念2.酶联免疫吸附实验（ELISA）定量检测应用3.ELISA实验主要设备—移液器基本使用主要内容第一部分酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理及概念免疫技术酶促反应抗原抗体酶底物酶标抗原或酶标抗体酶联免疫吸附试验5什么是抗原？能刺激机体免疫系统并启动机体的免疫应答，且能与其免疫应答产物(抗体或免疫效应细胞)特异性结合，引起一系列生物学效应的物质。免疫系统抗原特异性抗体6抗原的特点免疫原性和抗原性免疫原性指抗原分子能够刺

2、激机体产生免疫应答(产生特异性抗体及免疫效应细胞)的性质。抗原入侵记忆细胞（对抗原有记忆功能）浆细胞特异性抗体效应B细胞活化分裂7抗原性指抗原分子与免疫应答产物(抗体或免疫效应细胞)发生特异性结合的性质。抗原失去致病能力8抗原决定簇大多存在于抗原物质的表面，有些存在于抗原物质的内部，须经酶或其他方式处理后才暴露出来。一个天然抗原物质可有多种和多个决定簇。抗原分子越大，决定簇的数目越多。抗原决定簇：抗体识别相应抗原并与之结合的位点抗原决定簇抗原决定簇具有两个以及两个以上抗原决定簇的抗原叫多价抗原9哪些物质可以

3、称之为抗原呢？大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素等都是抗原。可以引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染金黄色葡萄球菌常引起严重腹泻和败血症10病毒呈球形，衣壳由60个壳微粒组成，呈20面体立体对称，有HAV的特异性抗原(HAVAg)，每一壳微粒由4种不同的多肽（蛋白质）即VP1、VP2、VP3和VP4所组成甲肝病毒1973年Feinslone首先用免疫电镜技术在急性期患者的粪便中拍摄的甲型肝炎病毒(HapatitisAvirus,HAV)11甲肝病毒表面的VP蛋白是具有免疫原性的蛋白

4、，能刺激免疫系统产生特异性的抗体甲肝病毒12什么是抗体？抗体是在机体对抗原刺激的免疫应答中，效应B细胞产生的一类糖蛋白，能够与相应抗原特异结合、产生各种具有免疫效应的球蛋白。免疫球蛋白在甲型肝炎的感染过程中，机体都可产生抗HAV的lgM和lgG抗体。前者在急性期和恢复期出现，后者在恢复后期出现，并可维持多年，IgG抗体使得机体对同型病毒的再感染有免疫力。13什么是抗原抗体反应抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应抗原抗体反应的特点1.特异性抗原与抗体结合反应的专一性，是指抗原分子表面的抗原

5、决定簇与抗体的分子结合的特异性，这两个分子的空间结构是完全互补的。142.可逆性抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体3.阶段性第一阶段特异性结合阶段：反应快，不可见第二阶段反应可见阶段：反应慢，但会出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象我可找到你了15抗原抗体反应的特点4.比例性抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比例关系只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应，形成的免疫复合物沉淀最多、最大。而当抗原抗体比例超过此范围时，反应速度和沉淀物量都会迅速降低甚至不出现抗原抗体可见沉淀反应。沉

6、淀物形成量沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系16如何更加灵敏的检测抗原或抗体呢？你们都看不见我17放射性免疫标记技术18放射性免疫标记技术用放射性核素等标记物，标记抗体或抗原，进行的抗原抗体检测技术，既有抗原抗体反应的特异性，又有标记物的灵敏度。通过放射强度的改变，测定未标记抗原或抗体的含量。（放射性标记物对抗原抗体反应起到了放大的作用）缺点：放射性物质对人体会产生危害1959年由Yalow和Berson开创了放射免疫技术(radioimmunoassay，RIA）。这项技术开辟了医学检验史上的一个新纪元

7、。它使得那些原先认为是无法测定的极微量而又具有重要生物学意义的物质得以精确定量。酶具有可与抗原、抗体共价结合的基团高活性一个酶蛋白分子每分钟可以催化103-104个底物分子转化为有色产物用酶标记抗体（或抗原）建立免疫测定法，可以使免疫结果得以放大，保证了测定方法的灵敏度。酶可以取代放射性核素，作为一种更安全的信号，检测抗原抗体20Nakene和Pierce共同研究发现的酶标抗原或抗体的方法，他们共同发表了《酶标抗体：制备和抗原定位中的应用》，首先提出了免疫酶技术的基本原理酶标记抗原或抗体酶标抗原或抗体的原理

8、及方法戊二醛交联法过碘酸钠法目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。采用辣根过氧化物酶的原因分子量小：这使得它很容易结合到抗体分子上，且结合量大大增加，有助于信号的产生。辣根过氧化物酶的底物比较宽泛，且比碱性磷酸酶敏感。酶标抗体或抗原的原理辣根过氧化物酶中与酶活性无关的糖蛋白组分，在过碘酸钠作用下，其中的多糖羟基被氧化