2019-2020年高中生物第六章蛋白质和DNA技术6.1蛋白质的提取和分离1素材中图版选修.doc

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1、2019-2020年高中生物第六章蛋白质和DNA技术6.1蛋白质的提取和分离1素材中图版选修问题：斐林试剂和双缩脲试剂成份相同，为什么斐林试剂不能用来检测蛋白质？（1）溶液浓度不同斐林试剂中乙液为0.05g/ml的CuSO4溶液，双缩脲试剂中CuSO4溶液为0.01g/ml（2）使用原理不同斐林试剂是新配制的溶液，它在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红色的沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。用斐林试剂鉴定可溶性还原糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色→棕色→砖红色（沉淀）。鉴定生物组织中是否含有蛋白质时，常用双缩脲法，使用的是双缩脲试剂，发生的是双缩脲反应。双缩脲反应实质是在碱性环境下的

2、与双缩脲试剂发生的紫色反应。而蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，所以蛋白质都能与双缩脲试剂发生颜色反应，可以用双缩脲试剂鉴定蛋白质的存在。（3）使用方法不同斐林试剂使用时，先反溶液和溶液混合（将滴溶液滴入溶液中），而后立即使用,需要加热。双缩脲试剂使用时，先加入溶液（2mL），振荡摇匀，造成碱性的反应环境，然后再加入3~4滴溶液，振荡摇匀后观察现象。（4）颜色反应不同斐林试剂与还原糖混合是产生砖红色沉淀，双缩脲试剂与蛋白质反应产生紫色反应。一、植物组织蛋白质提取方法1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。2、把样品放在研钵

3、中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃4、提取上清液，样品制备完成。蛋白质提取液：300ml1、1Mtris-HCl（PH8）45ml2、甘油（Glycerol）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！二、植物组织蛋白质提取方法氯醋酸—丙酮沉淀法1、在液氮中研磨叶片2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基

4、乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！三、植物材料：水

5、稻苗，叶鞘，根1、200毫克样品置于冰上磨碎2、加lysisbuffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清3、重复离心5minlysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40四、蛋白质样品制备秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000r/min离心15min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巯基

6、乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)，6%TritonX-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000r/min离心15min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存五、植物根中蛋白质的抽取(1)sample,液氮研

7、磨(2)装1.5mlcentrifuge用tube(3)加1MKH2PO4K2HPO4700ul(4)12000rpm,4度,10-15minite(5)取上层液，蛋白质就在里面