实验4 细胞融合.doc

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1、实验4细胞融合〔实验目的〕1、了解细胞融合的原理2、掌握PEG介导细胞融合过程的操作〔实验原理〕聚乙二醇（PEG）分子能使细胞凝集，改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处的细胞膜脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞间接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。〔试剂材料〕1、仪器：倒置显微镜、水浴锅2、试剂（1）0.85%生理盐水（2）GKN液NaCl8g,KCl0.4g,Na2HPO4.2H2O1.77g,NaH2PO4.H2O0.69g,葡萄糖2g，酚红0.01g，溶于1000ml

2、重蒸水中。（3）50%PEG液临用前配制，50gPEG4000，在沸水浴中加热，冷却至50℃时加入预热至50℃的50mlGXN液，混匀，37℃备用。3、材料：鸡红细胞悬液〔内容方法〕1、抗凝的鸡血，加入4倍体积的0.85%生理盐水，为血细胞储备液，4℃冰箱可保存一周2、鸡血储备液1ml，加入4ml生理盐水，混匀后1200r/min离心5min，去上清，再加入生理盐水同样条件下离心一次。血细胞沉淀加入10mlGKN液制成鸡血细胞悬液3、取悬液进行计数，用GXN将红细胞稀释至3-4×107个/毫升浓度。4、取稀

3、释好的红细胞悬液1ml，加入0.5ml50%PEG混匀，37℃/39℃温浴20-30min。5、加入GKN溶液至8ml，37℃温浴20min。6、1200r/min离心5min，沉淀用GKN溶液再洗一次。7、收集沉淀，涂片，镜检。也可采用下面方法：1、细胞生理盐水洗涤后用GKN溶液制成5%悬液2、红细胞悬液1ml，1200r/min离心5min，去上清。3、细胞沉淀用手指轻弹使细胞疏松，再逐滴滴加50%PEG溶液0.5ml，1分钟之内加完，边滴加边轻晃细胞，使PEG与血细胞混合4、混合物在37℃温浴2min

4、。5、加入GKN2ml，37℃温浴5min。6、1200r/min离心5min，去大部分上清，沉淀涂片，晾干后观察。细胞融合过程：①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。〔注意事项〕1、高Ca2+浓度（1.27-1.80mmol/L）和高pH8.0-8.2能够提高细胞融合率。溶液中尽量减少可与Ca2+结合的溶质分子。2、必须严格控制PEG作用时间，通常处理1-2分钟。PEG和DMSO共同作用可提高细胞融合率

5、3、相对分子量在400-6000的PEG在40%-60%浓度范围内都能使细胞融合。一般来说，PEG浓度和分子量越大，细胞融合率越高，但其黏度和细胞毒性也增大。所以PEG浓度在40%、45%、50%时以PEG1000的融合效率最佳。浓度为55%-60%时以PEG400为佳。〔实验作业〕1、绘制观察到的融合细胞2、计算融合率