谷氨酸棒杆菌外排泵的研究

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1、微生物文献翻译谷氨酸棒杆菌中cpeA编码外排泵样蛋白的分析姓名：马得燕班级：生工124学号：2012013992谷氨酸棒杆菌中cpeA编码外排泵样蛋白的分析Soo-YeonSim1,Eun-JiHong1,YounheeKim2,andHeung-ShickLee1*1•牛:物技术和4：物信息学，高丽大学，世宗339-700,韩国共和国部2.东方医学，SEMYUNG大学，系忠清北道390-230,大韩民国（收稿2013年9月2日/修订2013年11月4日/接受2013年11月6日）摘要编码人肠杆菌嚓吟外排蛋白与

2、枯草芽砲杆菌的同源物的基因被确定在谷氨酸棒杆菌的棊因组中，并指定为cpeA。该基因编码一个假定的蛋白质产物，含冇12个跨膜螺旋，这是完整的膜转运蛋白的典型特征。为阐明基因的功能，我们构建了cpeA缺失突变体（AcpeA）和cpeA过表达菌株，并分析其生理特征。cpeA的缺失基因可能对细胞的生长没有关键影响。然而，相对携带cpeA过表达质粒（P

3、80-cpeA）的菌株，AcpeA菌株的细胞产量减少了10%。进一步分析鉴定P,8o-cpeA菌株对6・筑基嚓吟和6・筑基鸟H票吟类似物,而不是2・氨基喋吟和嚟吟核背类似

4、物的抗性增加。此外，该菌株对蔡唉酸和氨茉青毒索表现出抗性的增加。总的来说，这些数据表明，cpeA是一种新颖的多药抗性基因，而门对能有使细胞内部的有毒物质流出到环境中的功能，从而使细胞达到较高的细胞产量。关键词谷氨酸棒杆菌，cpeA,外排，嚓吟简介谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性细菌，并己被广泛用于发酵生产氨基酸和核廿酸（Leuchtenberger等人，2005）而氨基酸通常川作增味剂和饲料补充剂，喋吟核背酸如肌昔5，・一磷酸（IMP）和鸟昔5=—磷酸（GMP）用作风味增强剂。由于这种微生物的丄业重要性，其遗传和牛

5、物化学特征己经被广泛表征。此外，最近基因组序列数据的可用将有可能对生物体的遗传背景表达一个新的维度。细菌能表达人量的转运蛋口。谷氨酸棒杆菌基因组中包含超过200个被认为是参与多种分子运输的基因（池IB和中川，2003;卡利诺夫斯基等人，2003;汤川等人，2007）。许多参与氮基酸外排的转运蛋白已详细研究（伊果和SAHM,2003;马林和Kramer,2007）o众所周知，编码这些氨基酸出口的基因的过表达改善了各自的氨基酸生产谷氨酸棒杆菌菌株的性能。在枯草芽他杆菌中，pbuE（ydhL）基因是已知的嚓吟碱和嚓吟

6、核昔的外排泵编码（Johansen等人，2003;Zakataeva等人，2007）。它通过确保嚓吟碱的利用率和嚓吟工物合成之间的最佳平衡对维持瞟吟碱的最适细胞内水平起到了重要作用。该基因也能保护细胞免受有毒喋吟碱基类似物侵害（尼加徳和Saxild,2005）,并有助于稳定细胞能荷（Zakataeva等，2007）。在大肠杆菌中，yicM（NEPI）基因参与喋吟核莒如肌苜的流岀，但不参与游离碱如鸟喋吟和次黄卩票吟流fl!（Gronskiy等人,2005）推测YicM介导卩票吟核糖核昔酸的出口（形成为rRNA的降

7、解产物）在固定相。最近，谢利等（2011）能够通过引入大肠杆菌yicM基因导入核昔生产芽他杆菌菌株，以提高生产肌井。基于上述的知识，在本研究中，我们试图通过使用生物信息学工貝來隔离参与喋吟碱基和核背出口的谷氨酸棒杆菌的基因。随后，我们确定了cpeA基因和采用遗传学方法，了解其生理作用。根据获得的结果，我们提出了cpeA及其在谷氨酸棒杆菌屮的操作的潜在用途的作用。材料和方法细菌菌株，质粒和纶长条件谷氨酸棒杆菌AS019E12（Follettie等人，1993）被用于构建HL1264,它带有一个ANCgl2903（

8、即AcpeA）突变。谷氨酸林杆菌HL1263菌株携带着NCgl2903过表达质粒pSL461（即P180-cpeA）o谷氨酸棒杆菌细胞常规培养,在30°CMB（Follettie等，1993）培养基中。如先前所述制备用于谷氨酸棒杆菌培养的MCGC基本培养基（冯DER奥斯滕等人，1989）。大肠杆菌细胞在LB（Sambrook和Russell,2001）培养在37°C。碳源加入到以1%的最终浓度的基本培养基中。抗生素添加在下列浓度（微克/毫升）：氨节青需素50,氯每素34和卡那霉素30DNA技术和菌株构建如先前所

9、述（Park等人，2012）,对相关谷氨酸棒杆菌细胞进行常规DNA分析。谷氨酸棒杆菌△cpeA突变体菌株是根据由Schafer等人（1994）所描述的方法构造的。如卜■所示:从谷氨酸棒杆菌基因组的一个DNA片段,通过利用引物F1:5'-TGAATTTCTTCACAGCGGGC-3,R1:5'-CCCATCCACTAAACTTAAACAGACATACGCGCTGCCATTG-3'F2:5