香鱼Apo AI原核表达及鉴定【开题报告+文献综述+毕业设计】

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1、本科毕业论文系列开题报告生物工程香鱼ApoAI原核表达及鉴定一、选题的背景与意义香鱼属胡瓜鱼目香鱼科。地方又名香油鱼、瓜鱼、细鳞鱼、海胎鱼、秋生子，日本人称为鲇鱼。是一种中小型名贵鱼类，曾被列入“雁荡五珍”，在亚洲被誉为“鱼中珍品”。因其脊背上有一条满是香脂的腔道能散发出浓郁的芳香味而得名。香鱼肉质细嫩多脂，清香可口，无鱼腥味，比一般鱼类口感好，尤其是凫溪香鱼干，早在清代已远近闻名。香鱼营养丰富，其肌肉粗蛋白中含人体必需氨基酸含量高达68．85％，要比其他淡水鱼高出许多。香鱼为滤食性鱼类，在自然条件下，鱼苗主要摄食浮游动物和贝类幼体；长大后以石砾上附生的硅

2、藻、蓝藻及绿藻类为食。人工养殖香鱼，蚕蛹、螺肉、剁碎的鲜杂鱼虾及小麦粉、马铃薯、黄豆、米糠、青菜等均可作为饵料，也可使用香鱼专用饵料或鳗饵料。香鱼的分布范围很广，除我国外，日本、朝鲜也有分布。香鱼的人工养殖始于日本，中国的浙江省已有试验，河北省已养殖成功，台湾省则较为盛行。ApoAI是高密度脂蛋白(HDL)的主要组成蛋白，它能与磷脂、多种血浆因子及细胞受体结合，可以激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶，起着促进细胞内胆固醇的移出、酯化、转移以及调节HDL代谢的作用。载脂蛋白在脂蛋白代谢中具有重要的生理功能。一般认为载脂蛋白至少有下列五方面功能：与脂质的亲和作用，使脂

3、质溶于水性介质中；运输胆固醇和甘油三酯；作为脂蛋白外壳的结构成分，它能将各种脂质成分（胆固醇、甘油三酯和磷脂）结合在一起形成一个整体，与脂蛋白外生物信息相联系；以配体的形式作为脂蛋白与特异性受体的连接物；激活某些与血浆脂蛋白代谢有关的酶类。ApoAI的临床意义在于它的测定可以直接反映高密度脂蛋白胆固醇的水平，从而了解冠心病、糖尿病等疾病的严重程度。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：研究的基本内容：本课题通过构建香鱼ApoA-I原核表达载体，并转入大肠杆菌BL21pLysE进行诱导表达目的蛋白，为进一步基因功能研究奠定基础。拟解决的问题：香鱼ApoAI原

4、核表达及鉴定。三、研究的方法与技术路线：（一）研究方法1引物设计根据已获得香鱼ApoA-I基因序列设计原核表达引物：pApoA-I-1（+）：5'-CCATATGCGTACCTTGCAGGCTGATGA-3'；pApoA-I-1（-）：5'-GGAATTCTTATGCCTTAATGGACTCGCT-3'（下划线为添加的限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ的识别序列）。2原核表达载体构建2.1PCR产物切胶纯化以1.2.1中原核表达引物配对进行PCR扩增，PCR产物与10×LaodingBuffer混合，并在1%（w/v）琼脂糖凝胶中电泳（120V），EB染色后

5、漂洗，紫外灯下观察，切下预期大小的目的片段，用E.Z.N.A.TMGelExtractionKit（OMEGA）纯化，具体方法如下：1)手术刀切下含有目的片段的凝胶并置于Eppendorf管中，加300μlBindingBuffer后置55~60℃水浴10min，每隔2~3min颠倒混匀一次，至凝胶完全溶解；2)将混合液混匀后转入蓝管，10000g离心1min；3)加300μlBindingBuffer，10000g离心1min；4)弃滤液，加700μlWashBuffer于蓝管中，10000g离心1min；5)弃滤液，另加700μlWashBuffer于

6、蓝管中，10000g离心1min；6)弃滤液，13000g离心2min，彻底去除蓝管中的WashBuffer残留；7)加入30μlElutionBuffer于蓝管，室温静置1min，13000g离心1min，收集产物-30℃保存。2.2感受态制备采用CaCl2法制备感受态细胞，具体方法如下：1)接种-80℃长期保存的大肠杆菌菌株到5mlLB（每升含10gTryptone，5gYeastExtract，10gNaCl，pH7.0）液体培养基中，37℃摇床，200rpm，培养过夜（12h左右）；2)按1:100比例取50μl母液稀释到新鲜的5mlLB液体培养基

7、中，继续37℃摇床培养，200rpm，培养2h；3)取出菌液置冰上冷却10min，将冰冷的菌液1ml每管分装到1.5mL的Eppendorf管，8000g离心1min，弃上清；4)沉淀用200μl预冷的0.1mol/LCaCl2悬浮，冰浴30min后，8000g离心1min，弃上清；5)沉淀再用100μl0.1mol/LCaCl2重悬浮，冰浴放置5~24h备用。2.3转化和筛选克隆1)将10μlPCR产物加到100μl感受态细胞中，移液枪轻轻吹打混匀冰浴放置30min；2)在42℃水浴条件下热激90s，立即转移到冰上冷却2min；3)加入冰预冷的LB培养液

8、总体积至1ml，37℃摇床低速（170~180rpm）培养1h；4