肝糖原的提取、鉴定和定量第七实验室

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1、南方医科大学生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称Folin-酚试剂法测定蛋白质含量实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。一、实验目的1、学习并掌握肝糖原提取和鉴定原理和方法； 2、学习并掌握蒽酮比色测定糖原含量的原理、注意事项和操作方法；3、学习并掌握刻度吸管和微量加样枪的使用方式；4、正确掌握使用离心机的方法步骤；5、

2、熟练运用溶液混匀的各种方法；6、正确掌握溶液转移的操作；7、正确掌握使用分光光度计的方法步骤二、实验原理实验1肝糖原的提取与鉴定糖原是生物的主要储能物质之一，主要储存与肝细胞中，采用研磨匀浆等方法可以使肝细胞破碎。肝细胞破碎，细胞内容物流出。低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶并且使蛋白质沉淀，糖原则能够稳定地保存在上清液中，从而达到分离糖原与蛋白质等其他成分的目的。糖原不溶于乙醇但可溶于热水，故可以先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子

3、后呈现的颜色。此外，糖原还可以被酸水解成葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可以判定肝组织中糖原的存在。糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min后会出现砖红色沉淀。CuSO4+2NaOH=Na2SO4+Cu(OH)2↓2Cu(OH)2+C6H12O6=2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O2CuOH=H20+Cu2O↓(红色)Cu(OH)2====H2O+CuO↓(黑色)实验2肝糖原定量测定糖原在浓碱溶液中非常稳定，故可将肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，保留肝糖原。糖原可以被浓酸水解成葡萄糖，而浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成5-羟甲基呋喃甲醛

4、，该化合物与蒽酮脱水缩合可以生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10-100μg，溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比。利用该反应原理处理标准葡萄糖溶液，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。三、材料与方法：以流程图示意1、实验材料（1）肝糖原的提取与鉴定样品：1.50g的鸡肝试剂：5%三氯醋酸溶液、95%乙醇、蒸馏水、浓HCl溶液、50%NaOH溶液、碘试剂和班氏试剂仪器和器材：离心机、天平、试管、试管架、研钵、玻璃棒、室温-100℃恒温水浴箱、剪刀、镊子、刻度吸管、加样枪和白瓷反应板（2）肝糖原的定量测定样品：0.15g

5、的鸡肝试剂：30%KOH溶液、蒸馏水、标准葡萄糖溶液和0.2%蒽酮溶液显色剂仪器和器材：室温-100℃恒温水浴箱、比色皿、100ml容量瓶、分光光度计、试管、剪刀、镊子、刻度吸管和微量加样枪3、实验步骤与方法（1）肝糖原的提取与鉴定：鸡肝约1.5g,剪碎+1ml5%三氯醋酸，研磨至乳状+3ml5%CCl3COOH三氯醋酸，研磨成肝匀浆全部转入离心管中，离心5min(4000r/min)上清液(取2ml)沉淀（弃去）加碘试剂2滴加碘试剂2滴糖原溶液2滴糖原水解液糖原水解液2滴呈色对比+班氏试剂4滴+浓HCl5滴沸水浴15min,冷却+50%NaOH5滴

6、+2ml95%乙醇，混匀，静置10min离心5min(4000r/min)沉淀上清液（弃去）沸水浴2min,溶解沉淀糖原溶液1ml白瓷板孔穴中+50%NaOH5滴沸水浴15min,冷却+浓HCl5滴+班氏试剂4滴糖原水解液2滴糖原水解液混匀加碘试剂2滴蒸馏水2滴加碘试剂2滴糖原溶液2滴呈色对比沸水浴2min,观察变化图一：肝糖原的提取与鉴定实验流程（2）肝糖原定量测定冷却，全部转入100ml容量瓶中沸水浴15分钟鸡肝0.15g，加30%KOH1.5ml糖原的测定加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液图二：肝糖原定量测定试验流程取3支试管，按下表操作。试

7、剂（ml）空白管标准管样品管蒸馏水1.0——标准葡萄糖溶液—1.0—糖原提取液——1.00.2%蒽酮溶液2.52.52.5表一：糖原测定试管操作混匀，沸水浴10分钟，冷却至室温。在分光光度计620nm波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）。四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。1、实验现象实验一：肝糖原的提取与鉴定①所获糖原溶液如下图：图三：所获糖原溶液所获糖原溶液呈乳样光泽。②将糖原溶液滴到碘试剂中可以勉强看到溶液出现浑浊，砖红色沉淀不明显，说明样品鸡肝中糖原含量少。碘液+蒸馏水碘液

8、+糖原溶液图四：糖原溶液与碘试剂反应③糖原水解液与班氏试剂混合后溶液变深蓝。沸水浴加热2min后，产生浑浊，