细胞凋亡检测方法研究现状

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1、细胞凋亡检测方法研究现状张向丹摘要：细胞凋亡是生命科学FI前的一个研究热点.检测细胞凋亡的方法和技术取得了很人的进步•从早期细胞内某些基因转录表达的变化、代谢生理的变化,到晚期细胞形态的确诊、细胞内代谢物质的转变，从定性、定量到原位定性定量等，都发展了相对成熟的检测技术.根据检测时间的早晚，从形态学、生化特性和分子调控等层次综合分析了检测细胞凋亡的主要方法，并对相关研究进行了展望.关键词：细胞凋亡；检测方法；细胞坏死细胞凋亡(cellapoptosis)是细胞的自主性死亡过程，发生在生命个体生长发育的各个

2、阶段，是生物体内重要的生命现象，由Kerr等在1972年首先提出,由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色及在病理学研究中的重耍作用，引起了人们对其机制广泛而深入地研究，目前，细胞凋广成为生命科学界的热门话题Z-o在细胞凋亡的基础研究领域，如有关凋亡信号转导、基因凋控等方面的研究，以及在细胞凋亡的应用研究领域，诸如将细胞凋亡作为化疗药物的筛选模式、检测肿瘤组织切片屮凋亡细胞数以评价肿瘤预后等，都涉及到凋亡细胞的识别与检测这一基本问题，因此，选择合适的检测凋亡细胞的方法便成为各个实验室必须解决的

3、问题。1.细胞凋亡的形态学特征和生物化学改变典型凋亡细胞的形态学变化过程包括:早期细胞休皱缩，细胞器完整但紧密压缩,核收缩，染色质浓缩于核膜周边，然后核裂解成碎块，胞膜逐渐突起，出芽形成“大疱”，而后“大疱”从凋亡细胞表面脱离出来,形成凋亡小体，最后凋亡小体被吞噬细胞吞噬，一•般不岀现炎症反应。在凋亡检测时必须将凋亡与坏死区别开來，坏死是被动死亡，不受细胞口身基因凋控，是“他杀”；凋亡是主动死亡，是“自杀”。对二者进行区分的实验手段主要是依据以下两方而进行的。1.1形态学改变光镜下凋亡细胞核致密深染、胞体

4、变小、核有吋裂解成碎片。而坏死细胞形态学特征是细胞肿胀、胞膜破裂、细胞崩解。由光镜辨认的凋亡细胞较为特异、客观，且经济、简便、实用，常在体外药物诱导肿瘤细胞凋亡的实验及肿瘤组织切片中凋亡细胞的计数中用到。缺点是早期凋亡细胞由于还没有发生形态学变化而使计数结果偏低。另外，体外诱导培养细胞凋亡的实验中，随着诱导时间的延长及诱导剂浓度的增加，凋亡后期的细胞也会发生继发性坏死，因此必须把握好观察时间才能取得预期的实验效果。1.2生物化学改变凋亡细胞膜和染色质均发生改变。凋亡细胞膜虽有变化但仍完整,DNA染料碘化丙

5、噪(pwpidiumiodide,PI)不能进入,坏死细胞膜完整性被破坏,PI可与变性DNA结合，通过流式细胞术(flowcytometry,FCM)测定光散射强度可将二者区分开来。另外，活细胞膜脂质双层内侧的磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)H细胞发生凋亡后翻转至细胞外侧,抗凝剂annexin-V与PS有较高亲和力，用荧光标记的annexin-V与染料PI进行双染色，可以区分活细胞(annexin-V和PI双阴性。此外，凋亡发生时的另一个生化改变即是核酸内切酶被激活，核染色质从核

6、小体之间裂解成180-200bp整数倍的寡核甘酸片段，坏死细胞DNA断裂没有规律，因此，提取相应细胞的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，凋亡细胞呈梯状电泳图谱,坏死细胞则为弥漫的片状图谱。2.依据形态特征的检测方法光学显微镜、电了显微镜及流式细胞仪下的细胞形态结构的观察仍然是目前鉴定细胞凋亡的最可靠方法，而且随着染色技术的不断涌现，产生了很多检测方法.2.1光学显微镜检测细胞涂片或组织切片经过多种染色后，即可直接在光学显微镜下观察凋亡.如果同吋结合细胞免疫组化方面的手段，还可判别凋亡细胞的种类.细胞涂片或组织切片

7、经苏木精••伊红染色后，细胞核呈蓝黑色，细胞质呈淡红色；凋亡细胞在组织屮常单个散在分布，细胞核浓缩、染色致密、有破碎；而坏死组织则呈均质红染的无结构状态.经姬姆萨染色后，凋亡细胞的染色质浓缩，靠近核膜和核边有聚集现象、核膜有裂解、染色质分割成块和有凋亡小体产生等典型的细胞形态结构变化.经甲基绿-派若宁染色后，凋亡细胞的细胞核呈绿色或绿蓝色，胞质呈红紫色；而坏死细胞的细胞核染成绿色.总体來说，该方法简便易行，只是检出时期较晚，主观性较大，判断标准不易常握.2.2倒置显微镜检测将含有细胞的多孔培养板置倒置显微

8、镜下直接观察、照相，叮发现凋亡细胞一般体积小、有变形，细胞膜完整但有发泡，在晚期自凋亡小体.而坏死细胞的体积肿胀，细胞膜损坏或裂解成碎片，有时染色质呈网状.该方法适用于凋亡过程的动态观察.2.3荧光显微镜检测对体外培养的活细胞经荧光素处理后，可在荧光显微镜下直接观察细胞形态的改变.用叮噪橙染色后止常细胞核DNA呈黄色或黄绿色的均匀荧光，细胞质和核仁的RNA呈桔黄或桔红色荧光；凋广细胞的细胞核或细胞质内有致密浓染的黄绿色荧光，甚