色谱分析技术

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1、色谱分析技术高压液相色谱Martin和Synge在1941年就提出高效相色谱的设想，然而直到六十年代后期，由于各种技术的发展,高效液相色谱才付诸实现。这种色谱技术曾被称为高速液相色谱(HighspeedLiquidChromatography),窩丿七液相色谱(HighParss-ureLipuidChromatography),目前使用最多的名称是高效液相色谱(HighPe-rformanceLiauidChromatography,HPLC)。高效液相色谱已经广泛地应用，成为一项不可缺少的技术。它的主要优点是⑴分辩率高于其它色谱法；⑵速度

2、快，十几分钟到几十分钟可完成；⑶乘复性高；⑷高效相色谱柱可反复使用；⑸自动化操作，分析精确度高。根据分离过程中溶质分子与固定相相互作用的差别，高效液相色谱可分为四个基木类型，即液一尚色谱、液一液色谱、离了交换色谱和体积排阻色谱。高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴处：氨基酸及其衍生物；一有机酸；循体化合物；⑷生物殓;⑸抗菌素：⑹糖类;(7)口卜咻:⑻核酸及其降解产物;9)蛋白质、酶和多肽：(10)脂类等。一、分类高效液相色谱法可分为四个基本类型：即液一固色谱法，键合相色谱法，离子交换色谱法及体枳排阻色谱法。(-)液一固色谱法液一

3、固色谱法通常称吸附色谱法，吸附剂有活性碳，氧化铝和硅胶，在液一固色谱法中用的载体都是硅胶。硅胶对溶质，分子的吸附能力不是平均分布在整个硅脱表面的，在硅胶表面有一些区域与溶质分子强烈相互作用，这些区域为活性位置，硅胶与溶质分子间主要作用是偶极距力氢键及静电相互作用。极性越强，而化合物在硅胶柱上的滞留时间也长。在液一固色谱中，依靠流动相溶剂分子与溶质分子竞争固定相互活性位置，从而使溶质从色谱柱上洗脱下来。与硅胶表而活性位習结合力强的溶剂洗脱溶质分子的能丿J强,因而称强溶剂，反Z为弱溶剂。液一固色谱法的特点是适于分离色谱儿何界构体，可用丁•脂溶性化

4、合物质如磷脂，辎体化合物，脂溶性维生素，前列腺素等。(%1)键合相色谱法键合相色谱法是由液一液色谱法即分配色谱发展起来的。键合相色谱法将固定相共价结合在载体颗粒上，克服了分配色谱中由于固定相在流动中有微量溶解，及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定相不断损失，色谱柱的性质逐渐改变等缺点。键合相色谱法可分为正常相色谱法和反相色谱法。1•正常相色谱法在正常相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团，如一级氨基、氧基、二醇基、二屮氨基和二氮基等。流动相溶剂是与吸附色谱中的流动相很相似的非极性溶剂，如庚烷、已烷及界辛烷等。由于固定相足极性，因此流动溶

5、剂的极性越强，洗脱能力也越强，即极性大的溶剂是强溶剂。固定相与流动相的这种关系正好与液一固色谱法相同，称这种色谱法为正常相色谱法。尽管如此，正常相色谱法的分离原理主要根据化合物在固定相及流动相中分配系数的不同进行分离，它不适于分离儿何界构体。2•反和色谱法在反相色谱法中共价结合到载体上的固定相是一些直链碳氢化合物，如正辛基等。流动相的极性比固定相的极性强。反相色谱法在高效液相色谱法中应用最广泛。在反相色谱法中，使溶质滞留的主要作用是疏水作用，在高效液相色谱中又被称为疏溶剂作用。所谓疏水作用即当水中存在非极性溶质时，溶质分子Z间的相互作用、溶质

6、分子与水分子Z间的相互作用远小于水分子Z间的相互作用，因此溶质分子从水中被“挤”了出去。可见反相色谱中疏水性越强的化合物越容易从流动相屮挤出去，在色谱柱中滞留时间也长，所以反相色谱法中不同的化合物根拥它们的疏水特性得到分离。反相色谱法适于分离带有不同疏水基团的化合物，亦即非极性基团的化合物。此外，反相色谱法可用于分离帯有不同极性基团的化合物。可以通过改变流动相的溶剂及其组成和pH,以影响溶质分子与流动相的相互作用，改变它们的滞留行为。另外，反相色谱中水的流动相中占的比例伸缩性很大，可以/从0-100%,从而使反相色谱可用于水溶性、脂溶性化合物

7、的分离。反相色谱法中的固定相是被共价结合到硅胶载体上的直链饱和和烷绘，其链的长短不同，故长的是十八烷基，这也是使用得故多的I占I定相。直链饱和烷姪疏水特性随着碳氢链的长度而增加,在反相色谱柱中溶质山于疏水作用而滞留的时间也将随看碳氢链的长度而増加。在一般情况下这意味看用碳氢链长的反相色谱柱能得到较好的分辩率，在多数情况下是依靠反复來选择色谱柱。山于反相色谱法的固定相是疏水的碳氢化合物，溶质与固定相Z间的作用主要是非极性相互作用，或者说疏水相互作用，因此溶剂的强度随着极性降低而増加。水是极性故强的溶剂，也是反相色谱中故弱的溶剂。徃反相色谱中常常

8、用和基础溶剂，向其中加入不同浓度的、可以与水混溶的冇机溶剂，以得到不同强度的流动相，这些冇机溶剂称为修饰剂。反相色谱中蚁常用的有机溶剂有甲醇和乙膳，此外，乙醇、四氢