PCR基因扩增仪基础知识

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1、PCR基因扩增仪基础知识分子牛物学技术正以惊人的速度发展，特别是近20年来已经成为生命科学的一个主要的生长点。1976年cDNA克隆技术的建立，使分子生物学更加迅速广泛地渗透到医学各学科，发展了各学科的分了理论基础。1985年Mullis首先描述的多聚酶链反应(PCR,PolymeraseChainReaction),使一向昂贵、繁杂、严格的分子牛•物学试验能够在比较简易、经济的条件下有效的开展，是基因分析技术的一项重大突破。这一技术在很用的吋间里即风行全球，不同学科的科学家都蜂拥而上，在近年形成了分

2、了生物学领域的热潮，期望凭借这一工具来提高研究水平，解决所面临的一些难题。早在四十年以前人们对遗传基因的化学木质并不清楚，示来发现脱氧核糖核酸(DNA)是遗传信息的主要载体。DNA的基础构成单位是核昔，核苜的排列顺序规定遗传密码并形成了基因oDNA是双螺旋结构，以半保留的方式进行复制的(Warson,1953),1958Meselson证实了DNA半保留复制模型。60年代対基因表达和调控研究乂収得很大进展，从细胞中分离目的基因并在休外克隆和表达受到人们的普遍关注。由于对DNA连接酶及限制性内切酶的合理

3、使用，DNA重组到质粒或噬菌体载体中，在细菌中表达成为70年代基因克隆的最常用技术。Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA的设想，由于当时不能合成寡核廿酸及DNA测序等困难而受阻。肓•到1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的年轻科学家Kary.B.Mullis发明了PCR技术，使Khorana的设想得到实现。Saiki首次描述利用PCR方法扩增人珠蛋白DNA,并用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。Mullis最初建立的PCR方法使用三种

4、温度的水浴进行实验，所用人肠杆菌DNA聚合酶I的KLENOW片段催化复性引物的延伸，由于该猶不能耐受便DNA变性的高温，所以每—轮反应都需添加新的腮，产量不高且操作繁复，对实验操作要求较高，无法推广使用。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术。由于Taq酶能够耐受97.5°C加热5・1()分钟，因此使DNA变性的94°C加热不使其失活，整个反应只加一次酶即可，并且高温反应也增加了扩增的特异性和效率，易于白动化进行。Mullis因其杰出的贡献，1993年获诺贝尔化学奖。PCR

5、技术能快速特异地在体外复制冃的，理论上能将其量极微的(fgDNA)冃的基因在较短的时间内(1・2小时)扩增到极易检测的微克水平。PCR技术目前已经成为人们获得目标基因的最常用的方法之一。然而其基本原理并不复朵，主要包括模板DNA(目标DNA)加热变性；降温后反应混合物中特异性引物与单链DNA模板的复性；72°C条件下，Taq醜诱导引物借助模板信息由5'端到3'端延伸。每一轮反应，模板拷贝数都增加一倍，理论上n次循环后,扩增产物拷贝数为2E(n-l)0但在PCR反应后期由于底物的消耗,Taq酶活力的卜降

6、，PCR抑制物的增加，PCR反应的指数形式逐渐转化为线性形式进入扩增的平台期，实际上3()・35个循环，扩增倍数一般可达百力•倍。如果想再提高扩增产物的蜃，可以将产物DNA再稀释1000倍作为新的模板进行第二轮的PCR扩增，一般二次扩增后的DNA数量已达到所有分子生物学操作的要求。一、变性，DNA双螺旋结构的生物功能在于复制与转录，加热或在碱性条件下可以使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA,称Z为DNA变性。解除条件后，变形的单链DNA可以重新结合起来，再形成双链，称之为DNA复性，又叫退火。DN

7、A双链离解一半时温度称为解链温度(Tm)o不同DNA的解链温度不同，取决于DNA中G-C与A-T的含量的区别。G-CfrQ有三个氢键，A-T间有两个氢键，因此G-C比例大的DNA片段解链温度高，—•般，G・C含量每增加1%,PCR变性温度增加0.4°C。Tm范围通常一般在85-95°C之间，PCR变性温度选择94°C,变性时间为30秒到2分钟。二、退火，PCR反应体系的退火其实是模板少引物的复性。引物是少模板某区序列互补的一小段DNA片段。一般引物是人们根据冃标DNA的序列人工合成的，其长度在15・3

8、0碱基之间，引物的设计有一定的原则，但完全达到理论要求的理想引物，儿乎不存在。通常反应体系中包含两个引物所对应的模板区间的DNA片段。由于引物的浓度大大地超出体系屮模板的浓度，所以变性示，系统温度降低，首先是引物与单链模板DNA结合，形成局部双链，而不是原來的两条单链模板DNA再结合形成的完整的双链。三、延伸，PCR中链的延伸是有方向的，以引物为起点，从5'端到3'端延伸，这是由DNA聚合酶(Taq酶)决定的。Taq酶具冇DNA多聚酶的核心功能一以DNA