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1、2000;27(3)生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.·235·综述与专论Cre/LoxP系统在转基因小鼠上的应用策略朱焕章 史景泉(第三军医大学西南医院病理学研究所,重庆400038)摘要 Cre/LoxP位点特异重组酶系统已发展为在体内外进行遗传操作的一个新的有力工具.该系统在转基因小鼠上的应用,可使转基因的表达或靶基因的缺失/突变的位点特异DNA重组不仅发生在小鼠发育的某一阶段或特定的组织器官,而且,若与控制Cre表达或功能的诱导系统结合,则可以时空方式体现.这些基于重组
2、的策略可能对基因功能的研究和人类疾病的动物模型的建立产生深刻影响.关键词 整合酶/Cre,重组,基因表达调控,转基因,基因打靶,小鼠学科分类号 Q55,Q52,Q7,Q95 转基因小鼠(transgenicmice,TgM)主要是组酶可分为Int家族(integrasefamily)和通过经受精卵原核的显微注射技术或经胚胎干细胞resolvase2invertasefamily.Cre是来源于P1噬菌体(embryonicstem,ES)的基因打靶技术来制备的.cre基因所编码的一个38ku蛋白,属于Int家
3、族.由显微注射方法所产生的TgM,由于转基因既可它可识别P1基因组上由34bp核苷酸序列构成的被设计用以表达一个新的基因产物,也可被设计误称为LoxP的特异靶位点,并根据LoxP的方向性,表达(misexpress)一个正常基因,因此常被用来可在各种底物(超螺旋环状型,松驰型和线型进行基因功能获得性研究;而基于同源重组原理的DNA分子)上介导三种不同的重组事件:a1同向基因打靶技术,既可通过定点整合产生无效基因位点之间序列的缺失(图1a);b1插入序列(图(nullallele)以进行基因功能失去方面研究,又可
4、1b);c1两个反向位点之间序列颠倒(图1c).需特异性地在ES细胞基因组中某个已知序列的基因指出的是,Cre重组酶所催化的是一个可逆的重组位点引入预定的突变,以阐明该基因的功能及其与事件,重组结果代表着正负反应的平衡;重组的程相关疾病发生发展的关系,因而是建立功能基因组度与重组酶的表达水平相关.Cre催化重组的另外[1]一个重要特点是在位点特异重组反应的任何阶段模型以及人类疾病的动物模型的主要途径.然而,这些转基因技术仍存在着某些方面的局限性.上,不需要任何辅助因子参与;该特点使Cre/例如,通过显微注射技术
5、来制备TgM,由于某些LoxP位点特异重组酶系统成为可在各类种属上进[1,2]基因其表达产物常使细胞或胚胎不能耐受,妨碍了行意向DNA操作的有用工具.TgM家系的建立;基因敲除(knockout)小鼠由于靶基因在所有体细胞的基因组上都存在基因的缺失/突变,常不能成活,无法对发育后期的基因功能进行分析等等.Cre/LoxP位点特异重组酶系统与转基因技术和诱导基因表达或其功能的调控系统的结合,为上述问题的解决开辟了新的途径.本文图1Cre介导三种不同的重组事件就Cre/LoxP系统的特点,以及在转基因小鼠上的P:启
6、动子;#:LoxP;a,b,c,d:基因.应用策略,扼要综述如下.2 条件性基因表达1Cre/LoxP重组系统的特点 一般情况下,常选择有表达的或有表型的 位点特异重组酶是由酵母或细菌所编码、可识TgM来建立转基因家系.然而,对于某些转基因别特异靶位点并在其上催化断裂和重接、从而产生Tel:(023)68752281,E2mail:hzhagzhu@public.cta.cq.cn精确的DNA重组的一类酶.根据序列相似性,重 收稿日期:1999204205,修回日期:1999208202·236·生物化学与
7、生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.2000;27(3)来说,当其表达时,常导致小鼠不孕或胎儿死亡,应用的方法;该方法虽然使基因打靶技术可适用于因此通过繁殖来建立TgM家系是困难的.另外,任何外源目的基因,但也有一个严重的缺陷,即发在TgM家系建立上,存在着更为复杂的情况,如生同源重组的细胞基因组中总留有外源的选择标记转基因高表达的胚胎死亡后,那么弱表达的转基因(neo)基因;该基因可能影响相邻基因的表达,不胚胎则被选择,因而部分表型的观察可能会导致对利于对突变表型的精确分析.以Cre/L
8、oxP系统与转基因确切功能的误解.因此,若在TgM建系之基因打靶技术相结合的条件性基因打靶(condi2前,使转基因休眠(dormanttransgene),当建系tionalgenetargeting)将可克服上述的局限性.该之后,使休眠转基因激活,即条件性基因表达,那策略主要是运用DNA重组方法来构建打靶基因置2么就可克服上述问题.该策略是将LoxP和含有于同向LoxP之内的打靶载
