电子显微镜技术

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1、电子显微镜技术张盛周asdzsz@126.com2009透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)扫描电镜(scanningelectronmicroscope,SEM)(一)透射电子显微镜1.电镜简史1923年法国的德布罗意首先证实电子具有波动性。1926年德国的Busch从理论上设想了用磁场作为电磁透镜的提法。1931年德国柏林工科大学高压实验室的教授Max.Knoll和年轻助手Ruska等人，首先制成世界上第一台电镜，这台电镜没有聚光镜，加速电压7.5万伏，其放大倍数和分辨率还不如光

2、镜。1932年发表了他们的试制报告，人们把这一年定为电镜诞生年。2.基本原理电子束通过电磁透镜照射样品成像。3.基本结构(1)电子束照明系统(2)电磁透镜成像系统(3)真空系统(4)记录系统(5)电源系统4.电镜样品的制备(1)对样品的要求A.要求样品很薄B.要求很好地保持样品的精细结构C.要求样品有一定的反差电镜样品的制备(2)制样过程①取材[要领]准取要观察的部位。快1min内浸入固定液，以防细胞自溶。小利于固定液浸透。低温操作(0-4℃)降低酶的活性，以防细胞自溶。避免损伤不要拉、锯、压。②固定[目的]使细胞内蛋白质凝固，保持

3、细胞的固有形态和结构。防止细胞自溶。[方法]双重固定法2.5％的戊二醛4℃固定1-2小时，缓冲液冲洗1小时，1％的锇酸固定1-2小时。③脱水浓度酒精脱水④浸透⑤包埋环氧树脂包埋⑥修块，半薄(0.5-2微米)定位⑦超薄切片超薄切片机切片厚度判断──用反射光干涉判断暗灰色〈40nm灰色40-50nm─┐一般银白色50-70nm─┘切片金黄色70-90nm紫色〉90nm⑧电子染色醋酸铀－硝酸铅双重染色⑨干燥，观察电镜样品的制备5.负染色技术用重金属盐，如磷钨酸或醋酸双氧铀对铺展在载网上的样品进行染色，样品干燥后，整个载网上都铺了一薄层重金

4、属盐，而有样品的凸出地方则没有染料沉积，在样品凹陷处以及样品周围出现负染效果。适宜于观察一些生物大分子组成的结构，如病毒，线粒体基粒，核糖体以及蛋白纤维等。(二)扫描电子显微镜扫描电镜60年代才正式问世1.成像原理电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。2.扫描电镜制样技术①取材[要领]清除表面污染物，如粘液异物等。A.蒸馏水或生理盐水冲洗B.如粘液洗不净，可在脱水前用超声波处理。C.用稀胰蛋白酶等蛋白消化酶处理。D.有机溶剂洗或蒸馏──去油脂或蜡质。②固定戊二醛24小时左右1％OsO41小时左右洗涤三次

5、③脱水防止表面张力引起的标本变形临界点干燥利用CO2等过渡性液在临界状态时相界消失，表面张力消失的特点而达到标本干燥的技术。④贴标本标本粘在载物台上⑤喷金导电样品表面质地均一⑥观察