淋巴细胞培养技术

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1、一、苜蓿多糖对淋巴细胞的影响1材料与试剂1.1动物小白鼠1.2材料苜蓿多糖、RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、96孔细胞培养板、四甲基偶氮唑盐（MTT）、台盼蓝、尼龙毛、1.3试剂配制1.3.1RPMI-1640培养基配制100U/mL青霉素、125µg/mL链霉素将RPMI-1640干粉袋中的粉末用力往下甩，开口倒出粉末，量取800mL的三蒸水，先冲洗袋子至干净，然后加入2gNaHCO3，搅拌定容至1000mL，调pH值为7.1-7.3。过滤除菌，放于-20ºC储存。1.3.2胎牛血清将冷藏的胎牛血清放在4°C，使之融化一半，然后

2、室温放置使其完全融化。56°C水浴30min将其灭活，分装到15mL的离心管中，-20℃保存备用。1.3.3pH7.2PBS缓冲液准确称取8.0gNaCl，0.2gKCl，2.925gNa2HPO4·12H2O，0.2gKH2PO4，用三蒸水溶解，然后用HCl（1mol/L）调pH值至7.2，加水定容至1000mL，120°C高压灭菌，4°C保存备用。1.3.4红细胞裂解液称取NH4Cl4.16g，KHCO30.5g，Na2EDTA0.02g，溶于100mL蒸馏水中，调pH7.2，加水至500mL，存于4ºC。1.3.5MTT作用液称取50mgMTT

3、（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。），溶解在10mLPBS中，0.22μm的滤器过滤除菌，4℃避光保存。（MTT有致癌性，用时需戴透明PE手套）2（1）T、B淋巴细胞制备：①颈椎脱臼法处死，用75%酒精消毒，浸泡1-2min，在超净工作台中取出脾脏，用灭菌生理盐水冲洗3次，剔除脂肪和结缔组织，置于含D-Hanks（相当于生理盐水）无菌培养皿里，放入含D-Hanks液的平皿中用灭菌的剪刀、镊子把器官剪碎，在200目的细胞筛网上挤压研磨过滤，收集细胞悬液。将Percoll分层液1mL加到10m

4、L试管中，缓慢贴壁把以上淋巴细胞悬液加到分层液上面，把试管用橡皮塞塞紧，以3000r/min离心15min；后用移液管吸出淋巴细胞，用完全RPMI-1640洗2次，倒出上清，再准确加5mL完全RPMI-1640培养液，用枪头吹吸使之混匀，计数板显微镜下计数；计数以后以1000r/min离心5min；离心以后弃去上清液，加适量的完全RPMI-1640培养液将细胞调成2×107个mL-1，并用台盼蓝染色检测细胞活力大于95%，即得到淋巴细胞培养液。②T、B淋巴细胞的纯化[1]：尼龙棉以0.2mol/LHCl浸泡6h，再用大量蒸馏水反复冲洗，晾干。称取尼龙

5、棉50mg，将其仔细撕开装填入10mL注射器内，高压灭菌。尼龙棉柱高度为6cm，可有效地过滤（2~3）×107个细胞。用D-Hanks液和RPMI-1640（含10%胎牛血清）培养基洗柱各2次，以平衡pH、温度、排除空气，37°C放置1h。上柱前，先将平衡液放出，垂直滴加入淋巴细胞悬液0.5mL，平放尼龙棉柱，以细长的毛细滴管伸入柱内界面加入培养液0.5mL封口，将柱于37°C静置孵育1h，用预温的培养液淋洗柱2~3次，流速控制在1mL/min，收集最初的10mL流出液，1300r/min离心10min，此即分离的纯化T淋巴细胞。再用培养液边洗脱边挤

6、压尼龙毛柱，用钢针缓缓从上至下挤压尼龙棉，使柱中细胞挤出，收集的洗脱液是B淋巴细胞，1300r/min离心10min，此即分离的纯化B淋巴细胞。③流式细胞术测定T、B淋巴细胞纯度：取2个流式上样管，其中2管为纯化前的脾细胞悬液对照组，用于测定分选前T、B细胞含量，另外2管为纯化后的T、B淋巴细胞样品组，用于测定分选后T、B细胞含量。向各管中分别加入5×105个脾细胞或T、B淋巴细胞，并在管中补入含1%FBS的PBS溶液，使得各管总体积为0.5ml，4°C条件下1000rpm×5min离心，然后小心倾倒上清，向管底相应加入小鼠Anti-CD3-FITC

7、或Anti-CD19-PE荧光标记抗体100µl/管（含荧光标记抗体原液1µl），轻微震荡混匀，避光反应30min。每管加入0.5ml含1%FBS的PBS再次洗涤细胞，倾倒上清，加入0.5ml含1%FBS的PBS缓冲液重悬细胞，锡箔纸避光处理样品管，然后分别上流式细胞记数仪检测细胞纯度。④将分离的T或B淋巴细胞培养于RPMI-1640（含10%胎牛血清）完全培养基中，调整细胞数为5×106mL-1。吸取100µL细胞悬液加至96孔细胞培养板中，分别加入不同浓度的苜蓿多糖，使其终浓度为12.5、25、50、100、200µg/mL，每样均设置3个重复，

8、并设空白对照孔，置CO2培养箱（5%CO2、37ºC）培养48h。（2）MTT法测定淋巴细胞增殖活性（增值指