多环麝香污染对蚯蚓的影响探析

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1、多环麝香污染对蚯蚓的影响探析IISP70是HSP家族中最保守和最重要的一类应激蛋白,其自身表达水平与生物体受环境胁迫时细胞组织损伤及自身防御能力关系密切[9]・钙网蛋白是动物和咼等植物体内普遍存在且高度保守的一种内质网钙结合蛋白，具有维系细胞c&2+稳态、调节蛋白质折叠和细胞凋亡等多种生物学功能[10]・ilerova等[11]首次克隆蚯蚓Eiseniafetida的cRT基因并鉴定其生物功能.亲环素A作为一类具有肽基脯氨酸顺反异构酶活性的免疫亲和素，主要参与免疫调节和信号转导，并发挥细胞因子的功能，在细胞生命活动中发挥重要作用，且对生物体炎症的发生、细胞凋

2、亡等具有调控作用.翻译控制肿瘤蛋白最初发现于肿瘤组织，被认为是一个在翻译水平受到抑制的肿瘤相关蛋白，而后被发现是一种普遍存在并且大量表达的蛋白，在进化上高度保守，主要参与细胞周期的调控，对肿瘤细胞增殖和凋亡具有双重作用.目前，关于外源污染物暴露胁迫下蚯蚓特异性蛋白基因表达的研究还较为缺乏.鉴于污染物与生物体之间的相互作用始于分子水平[12,13],因此，有必要开展分子水平上多环麝香土壤污染胁迫蚯蚓特异性蛋白基因响应表达的研究.本研究以蚯蚓HSP70、cRT、cyPA、TcTP等胁迫蛋白类基因为主要对象，通过检测分析低剂量AHTN或HHcB长期暴露胁迫下各特异

3、性蛋白基因在转录水平上的表达量，以期筛选出敏感的分子生物标志物，应用于多环麝香污染土壤中亚急性毒性效应的早期分子诊断和生态风险评价中.1材料与方法供试污染物和供试动物吐纳麝香购自上海力智生化科技有限公司，纯度99%;佳乐麝香购自天津中科健化工有限公司，纯度99%.毒理实验中采用的蚯蚓为赤子爱胜蚓，是国际标准毒理试验模式生物之一，购自南开大学教研基地天津芦台贾立明蚯蚓养殖场.选择2〜3个月龄、有明显生殖环带、体重为400~450mg的已筛选驯化后的成年蚯蚓作为供试受体生物.实验方法蚯蚓特异性蛋白基因mRNA表达的RT-qPcR检测按照试剂盒说明书Trizol法

4、提取蚯蚓总RNA[14].取1卩g总RNA,采用逆转录酶ReverTraAce-a-合成cDNA.根据GenBank已发表的蚯蚓HSP70、cRT、TcTP、cyPA等基因cDNA序列信息,采用设计RT-qPcR扩增引物.RT-qPcR扩增反应体系为20uL,其中SyBRGreenImixlOnL,uL,上下游引物各uL,uL.反应条件为95°C预变性2min,45个循环.PcR反应结束后熔解曲线分析:95°Clmin;60°Clmin,60°C30s后，温度。C・s—1递升至95°C结束.PcR产物经纯化、连接转化、克隆筛选等操作步骤，任选3个重组质粒由北

5、京华大基因公司测序.采用NcBI数据库中BlastX程序将供试基因与已发表基因间序列进行同源性比较.或HHcB28d暴露胁迫下蚯蚓特异性蛋白基因表达供试自然土壤取自天津塘沽森林公园，为未受工农业污染的洁净表层土壤，风干后过2mni筛待用，土壤理化性状、污染物土壤背景值以及土壤染毒与配制具体方法见笔者前期研究[7]・根据AHTN与HHcB土壤亚急性毒性的效应浓度[7],土壤长期暴露实验染毒浓度设置5个梯度水平，分别为3、10、30、50和100ug-g-l.早期研究表明[17],丙酮经过充分挥发后对蚯蚓几乎无毒性影响，而且去离子水与丙酮对照组中基因表达水平无差

6、异变化，因此，本研究仅设置丙酮试剂空白作为对照组.每个浓度处理组与对照组均设置4个平行.暴露28d结束后，分别于各处理组中任意挑选4条蚯蚓，即每条蚯蚓作为一个待测样品，重复4次，进行基因表达水平的定量分析.数据处理与分析以B-actin作为持家基因，对各供试目的基因mRNA表达水平进行定量分析。基因表达数据以平均值土标准偏差的方式表示.数理统计均采用软件包分析.不同处理组间的比较采用单因素方差分析，多重比较采用Duncan法，显著性差异水平为P＜。2结果与分析蚯蚓总RNA的纯度与完整度由图1可见，蚯蚓总RNA完整性较好，其28S与18S条带清晰;并且RNA的

7、A260/A280比值均在〜之间，表明抽提的总RNA纯度较高.因此，Trizol法提取RNA可满足cDNA合成和RT-qPcR反应需求.引物设计合理性的验证通过测序比对结果可知，供试基因分别与已收录的HSP70、cRT、cyPA和TcTP基因序列信息高度相似，表明RT-qPcR引物的设计可满足目的供试基因片段扩增检测要求.各供试基因的熔解曲线皆为特异的单个峰，没有出现引物二聚体与非特异性扩增，更加说明本研究引物设计以及RT-qPcR反应体系条件的建立适用于供试基因的特异性检测.、HHcB28d暴露胁迫下蚯蚓特异性蛋白基因mRNA的响应表达暴露于AHTN或HH

8、cB污染土壤28d后，蚯蚓各目的基因HSP70、cR