第5章 子房、胚珠和合子培养与离体受精

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1、第五章子房、胚珠和合子培养与离体受精★子房：子房壁、胚珠、胚囊★胚囊：1个卵细胞、2个助细胞、反足细胞★未传粉子房培养：培养接受花粉之前的子房诱导胚囊分子产生单倍体，进行离体授粉、受精和远缘杂交。★传粉后子房或胚珠培养：研究果实和种子发育，代替胚胎培养拯救早期败育的杂种胚传粉后子房培养☆研究目的：研究果实发育的营养需求和激素调控。☆连着部分花器官的传粉后子房更易培养☆保留颖片和稃片的子房培养未传粉子房培养与离体受精☆未传粉子房培养：诱导卵细胞或胚囊分子产生单倍体。☆雌蕊离体授粉技术：将不同发育阶段的子房连同一段花梗，经表面消毒，接种到琼脂培养基上，授以无菌花粉

2、。☆培养基：MS，最好添加酪蛋白水解物、GA3、KT。胚珠培养与离体受精☆用带胎座的胚珠进行培养，将花粉授在胚珠的珠孔端☆胚珠包裹在子房中，处于无菌状态。试管受精在育种上应用☆在一定程度上克服远缘杂交的不亲和性。☆克服一些植物的自交不亲和性。第二节离体受精与合子培养离体受精与合子培养的意义：1、在生殖生物学基础研究上有重要意义2、可以克服生殖隔离，在人工条件下实现不同种属间的精卵融合，产生杂种合子，拓宽远缘杂交范围。与原生质体融合和体细胞杂交相比，离体受精产生的杂种合子具有自然的胚胎发生能力，更有实用价值。3、离体培养合子是基因工程的理想受体，外源基因可直接导

3、入，无需使用对人类或生态环境有害的选择标记基因。离体受精与合子培养的4个关键步骤1、精子的分离2、卵细胞的分离3、精卵离体融合4、合子离体培养精子的分离※三细胞花粉：禾本科与十字花科植物，花粉中含有一个营养细胞和两个游离在营养细胞的细胞质中的精子细胞，为三细胞花粉※二细胞花粉：茄科和百合科植物，花粉中有一个营养细胞和一个生殖细胞，为二细胞花粉。花粉萌发后，生殖细胞在花粉管中分裂形成两个精子。※三细胞花粉，可以直接从成熟花粉中分离精子；二细胞花粉，需要先进行花粉的离体培养，待精子形成后，再从花粉管中分离精子。三细胞花粉的精细胞分离1、渗透压冲击法：花粉置于低渗溶

4、液中，吸水破裂，释放出精细胞。经低速离心，得到精细胞。优点：花粉壁碎片大，易于过滤清除。缺点：渗透压突然变化对精子生理状态不利。2、研磨法：成熟花粉悬浮于适当溶液中，研磨使花粉破裂，释放精细胞。优点：不过分依赖花粉成熟度，特别适合于在低渗溶液中不易破碎的花粉。缺点：花粉壁碎片小，不易清除。二细胞花粉的精细胞分离1、花粉离体培养法：花粉在液体培养基中人工萌发，待形成精细胞后，用渗透压冲击或研磨使花粉管破裂。缺点：精细胞形成不同步，分离的精细胞中混杂尚未分裂的生殖细胞，使精细胞纯度降低。2、活体－离体法：先将花粉授在柱头上，花粉萌发并产生精子后，用渗透压冲击法分离

5、。优点：分离的精细胞纯度高，接近受精前的发育状态。3、改进的活体－离体法卵细胞的分离※可先分离胚囊，从中分离卵细胞※也可直接从胚珠中分离卵细胞※周嫦和杨弘远首先建立胚囊分离技术－酶解振荡法。※生活胚囊的分离方法：胚珠放在酶液中，酶液：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、蜗牛酶或崩溃酶。※后发展为酶解－渗透压冲击法卵细胞与胚囊其它细胞的分离11、酶解法：延长酶解胚囊时间，使胚囊壁降解，卵细胞和其它细胞释放出来。酶解与研磨相结合。优点：操作简单，适合分离大量胚珠缺点：分离率偏低，影响材料生活力。适合于：胚珠小而数量多，珠心薄的材料，如烟草。2、解剖法最佳解剖方式：横断胚

6、珠，卵细胞与合子保持原位，易于分辨与操作。优点：操作准确度高，分离率高，无酶解伤害，易保持材料生活力。缺点：需要熟练的操作技巧，分离速度慢。适合于：胚珠较大、数量较少、珠心厚的材料，如禾本科植物。卵细胞与胚囊其它细胞的分离2酶解－解剖法优点：分离率较高缺点：酶解若过度或清洗不彻底，会对后期合子培养产生不利影响。精卵离体融合精卵自发融合率很低，采用诱导融合方法：1、电融合：融合率高，但依赖于特制的自动化操作系统。2、Ca2+诱导融合：钙离子促进精卵细胞特异性融合3、PEG（聚乙二醇）诱导融合