生物工业分析 第5章 比色分析和分光光度法

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1、生物工业分析第五章　比色分析和分光光度法第一节　概述第二节　比色分析与分光光度法第三节　紫外分光光度法第四节　其它分光光度法简介比色分析和分光光度法第一节　概述比色分析和分光光度法具有以下优点：①灵敏度高；②准确度较高；③操作简便、分析速度快；④应用广泛。比色分析和分光光度法第二节　比色分析与分光光度法一、基本原理1．朗伯—比尔定律比色分析与分光光度分析定量物质的基础是朗伯-比尔定律（Lambert-Beer）：当一束平行单色光通过均匀、非散射的稀溶液时，溶液对光的吸收程度（即为吸光度A）与溶液的浓度和液层的厚

2、度的乘积成正比。A=KCL式中：A——吸光度；K——吸光系数；L——液层厚度；C——被测物质的浓度。气相色谱分析通常用光吸收曲线来描述待测溶液对各种波长光的吸收情况，将光源中不同波长的光依次通过固定浓度的待测溶液，分别测出溶液在不同波长下的吸光度，以波长λ为横坐标，以吸光度A为纵坐标绘制的曲线称为光吸收曲线或吸收光谱曲线。在光吸收光谱曲线上，光吸收程度最大处对应的波长为该物质的最大吸收波长，用λmax表示，最大吸收波长对应的颜色就是物质吸收光的颜色。在一定条件下物质的吸收强度与其浓度成正比关系，这是物质进行定量

3、分析的依据。在各种物质的分子吸收光谱中吸收峰的波长位置、吸收峰的相对强度以及吸收峰的形状（峰宽）是对物质进行定性与结构分析的依据。气相色谱分析2．仪器及使用方法（1）581-G型光电比色计　581-G型光电比色计光学系统如图5-1所示。图5-1　581-G型光电比色计光学系统1—光源2—反射镜3—吸热玻璃4—聚光镜5—滤光片6—比色皿7—硒光电池8—检流计气相色谱分析其中光源灯泡是6.3V的钨丝灯泡；滤光片的作用是从白光中把最能为被测溶液吸收的某波段的单色光分出来，除去不被溶液吸收且干扰测定的其他波段的光，比色

4、分析选用的滤光片的颜色应该是溶液的互补色，每块滤光片上都标有该滤光片允许通过的光波的波长数值，单位为nm。581-G型光电比色计配有3块滤光片，即红（650nm）、绿（530nm）、蓝（420nm）色滤光片。括号内波长表示该滤光片最强透过光的波长。选择滤光片的原则是，滤光片透过的光应是溶液吸收最强的光，这可根据颜色的互补关系来选择，见表5-1。气相色谱分析溶液颜色滤光片的颜色滤光片能通过的波长（nm）黄色青紫400～435黄蓝435～480桔红绿蓝480～490红蓝绿490～500紫绿500～560青紫黄绿56

5、0～580蓝黄580～595绿蓝桔红590～610蓝绿红610～750表5-1　溶液颜色与滤光片互补关系气相色谱分析（2）721型分光光度计　它的工作波长范围为420～720nm,主要是专供一般化验室在可见光区作常规定量比色分析。721型分光光度计原理示意图如图5-2所示。图5-2　721型分光光度计原理示意图1—光源2—聚光透镜3—反射镜4—弯曲狭缝5—保护玻璃6—准直镜7—棱镜8—光亮调节器9—聚光镜10—吸收池11—光门12—保护玻璃13—光电管14—直流放大器15—微安表气相色谱分析721型分光光度计的

6、使用方法如下:①在仪器接通电源以前,先将各种控制旋钮开关置于关的位置上,并打开比色皿盒上的翻盖。②预热20分钟，同时启动检流计的电源开关，调节检流计的零点粗、细调节器，使透光度为100。待仪器稳定后再使用。③选择测定波长。④将盛有溶液的比色皿放在比色皿架上，空白溶液放在第一格内，显色溶液放在其它格内，把暗箱盖好。气相色谱分析⑤用空白溶液调透光度为100。然后将比色皿定位拉杆依次轻轻拉出，使待测溶液依次进入光路，读出吸光度或透光度。必要时可将空白溶液推入光路核对吸光度零位，再读数一次。⑥使用完毕，应将比色皿盒上的

7、翻盖打开，切断检流器电源，最后切断仪器电源，将仪器用盖好。同时用蒸馏水将比色皿洗涤干净，存放于比色皿专用盒内。使用时应注意以下事项:①仪器连续使用2小时后，最好休息半小时，再继续使用；②操作时，应尽量避免试液滴入比色皿暗盒内或仪器的面板上，若有滴出应及时揩干，以免腐蚀仪器。气相色谱分析二、定量分析方法（1）标样计算法　此法使用于个别样品的分析。首先测出标准溶液（浓度为Cs是已知的）的吸光度As，然后在相同的条件下测出样品溶液的吸光度Ax（由于实验条件相同，故K、L为定值，符合比尔定律）。依公式CxAs=CsAx

8、可计算出待测样品的浓度。（2）标准曲线法　此法适合于成批试样的分析。首先配制一系列不同浓度的标准溶液，分别测定其吸光度，以浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标绘制标准工作曲线。样品也经过同样的处理，在和标准溶液相同的条件下测吸光度。根据样品的吸光度在标准工作曲线上查出相应的浓度。气相色谱分析三、应用实例1．啤酒色度的测定①基本原理啤酒（或麦汁）的色泽越深，则在一定波长下的吸光度越大，因此