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1、第一章基因工程第一节基因工程概述一.基因工程的概念操作环境操作对彖操作水平基本过程结果生物体处基因分了水平剪切f拼接一导入f表达人类需要的基因产物由于基因工程是在DNA分子水平上进行操作，因此乂叫做重组DNA技术。二.基因工程的基本工具（_）“分了手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶）1.來源：主要是从原核牛•物中分离纯化出來的。2.功能：能够识别双链DNA分了的某种騒的核苛酸序列，并R使每一条链中特定部位的两个核背酸之间的磷酸二酯键断开。3.结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。（二）“分了针线”一DNA
2、连接酶1.分类：根据酶的來源不同，可分为E・coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类2.功能：恢复被限制師切开了的两个核昔酸之间的磷酸二酯键。★两种DNA连接酚（E・coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键②区别：E.coliDNA连接酶來源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接;t4dna连接酶能缝合两种末端,但连接平末端Z间的效率较低。★DNA连接酶与DNA聚合酶作川的比较DNA连接酶DNA聚合酶不同点连接的DNA咫链里链模板不要模板要模板连接的対象2个DNA片段单个脱氧核背酸加到已存在的单链DNA片段上相同
3、点作用实质形成磷酸二酯键化学本质蛋白质（三）"分子运输车"载体1•载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存；②貝-有一•至多个限制酚切割位点,供外源DNA片段插入；③具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。2.基因工程常用的载体有：质粒、噬菌体和动、植物病毒等。最早应用的载体是质粒,它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。三.基因工程的基本过程—（一）获得目的基因（目的基因的获取）1.获取方法主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出來，如可从基因文库中获取。②用人工的方法合成。★获得原核细胞的目的基因可采収直接分离,获収真核细胞的
4、目的基因一般是人工合成。★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。2.利用PCR技术扩增fl的基因（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸仑成技术。（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA双链复制（4）过程：笫一步：加热至90〜95CDNA解链为单链;第二步：冷却到55-60°C,引物9两条单链DNA结合;笫三步：加热至70-75°C,热稳定DNA聚合酶从引物起始进行耳补链的合成。（5）特点：指数形式扩增（二）制备重组DNA分了（基因表达载体的构建）1.重组DNA分子的组成：除了目的基因外，还必须有标记基因
5、。★标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含侑目的基因的细胞筛选出來。2.方法：也凰限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接嗨把两者连接。（三）转化受体细胞（将冃的棊因导入受体细胞）1.转化的概念：是貝的基因进入受体细胞内,并R在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：①将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术（农杆菌转化法）,-其次还冇基因枪介导转化技术（某因枪法）和花粉管通道技术（花粉管通道法）。②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。③将口的基因导
6、入微牛物细胞：Ca十处理法。（四）筛选岀获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达（目的基因的检测与鉴定）1•首先要检测转基因牛•物的染色休DNA上是否插入了口的廣因,方法是釆用DNA分子杂交技术。2.•其次还要检测目的基因是否转录出mRNA,方法是采用DNA分子杂交技术。3.故后检测H的茶因是否翻译成蛋白质,方法是采川抗原一抗体杂交技术。4.有时还需进行个体牛•物学水平的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。第二节基因工程的应用1.运用基因T程改良动植物品种最突出的优点是：能打破常规冇种难以突破的物种之间的界限。2.基因工程的应用（1）植
7、物基因工程：抗虫、抗疚、抗逆转基因植物,利用转基因改良植物的品质。（2）动物基因工程：提高动物牛•长速度來提尚产品产量、改善产品品质,用转基因动物生产药物,用转基因动物作器官移栢的供体等。（3）基因诊断和基因治疗:基因诊断：乂称为DNA诊断，是采用基因检测的方法來判断患者是否出现了基因界常或携带病原体。基因治疗：抬利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。实例：ADA基因缺陷症的基因治疗第三节蛋白质工程1.蛋白质丁程的实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系,通过改造基因,以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。2.蛋
8、白质工程的基木原理预期蛋口质功能〜测定蛋口质三维空间结构一推测应有的氨基酸序列一找到对应的脱氧核廿酸序列（基因）一具有预期功能的蛋白质1.蛋白质工程的
