高效液相色谱基础

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1、高效液相色谱基础一、基础理论1、液和色谱系统组成溶剂瓶——真空脱气——混合器——泵——进样器——色谱柱——检测器——数据采集2、分离过程分离过程是待测化合物在固定相和流动相中的连续分配平衡的过程。待测样品经流动相通过柱，不同组分的分配系数不等，则被流动相携带移动的速度不等，分配系数大的组分在色谱柱中停留的时间长，反Z则短，从而使不同组分得到分离。3、液相色谱种类反相色谱(RPC)：是药物分析中最常用的方法。正相色谱(NPC)：在建立HPLC方法时，应首先试用RPC,如RPC不适合则改用NPC。理由：样品不为RPC保留。样品为RPC强烈保留。RPC不能达到适当的分离度。样

2、品含位置异构体、立体异构体或非对映异构体，NPC有较大的选择性。样品溶丁非极性溶剂，不溶于极性溶剂-水混合物。样品在水溶液中会分解。离子对色谱分子排阻色谱（SEC）：又称凝胶色谱、尺寸排阻色谱。利用被分离物质由于分子大小不同导致在填料上渗透程度的不同使不同分子量的组分得到分离。填料为带有一定孔径的惰性填料：分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等。是分离蛋白质、多肽、核酸的重要方法。离子交换色谱：固定相上结合了带电官能团，能滞留带相反电荷的离To主要用于无机盐、生物來源样品（氨基酸、肽、蛋口质、寡核甘酸及核酸）和某些有机金属化合物。手性色谱法：间接法：手性衍生

3、化，采用对映体纯的手性衍牛化试剂与手性样品分子反应生成非对映异构体，用常规HPLC分离。直接法：手性流动相添加剂。较少应用。手性固定相：已成为主要方法。将手性物质化学键合或涂布在担体上形成手性I古I定相。手性固定相与被分析的对映体相互作用形成非对映异构配合物。其结合强度不同，故保留不同，得以分离。4、基本概念和几个重要参数色谱图：样品被流动和冲洗，通过色谱柱，流经检测器，所得到的信号■洗脱时间曲线。基线：监测器中只有流动相通过或有组分通过而不能为检测器所检出时，所得流出曲线。噪音漂移色谱峰定性参数：保留吋间（tR）保留体积（VR）柱效参数：区域宽度：标准偏差（。）半峰宽

4、（"或并/2）峰宽（w或r）理论塔板数（n）与理论塔板高度（H）相平衡参数分配系数（K）K=Cs/Cm容量因子（k）：遴IJ分配平衡后组分在固定相中的量（吧）与在流动相中的量（”m）的比。选择性因了（Q）:相邻两组分的分配系数之比或容量因了之比。分离参数分离度（R）湘邻两峰间的距离与平均峰宽的比值。R21.5称为完全分离。R=血2漁1）/（W]+W2）/2二、流动相溶剂：水最好用超纯水，或者用双蒸水。缓冲盐也耍用高纯度的，缓冲液要用溶剂过滤器过滤。有机和：一定要用HPLC级的。水最好用新鳞的，放置过夜后要过滤。流动相故好新鲜配制。溶剂瓶：仪器配备的专用溶剂瓶，可用普通试

5、剂瓶。应定期用酸、水和溶剂清洗。普通试剂瓶用了一段时间后应扔掉，更换新的。过滤器：流动和先经过滤器过滤后再进入色谱系统，过滤器使用…段时间后也要清洗。安捷伦HPLC使用的玻璃过滤器可用酸泡过后再用超纯水清洗干净。流动相的脱气：溶于流动相的空气会在泵内产生气泡，导致流量不稳，如有大量气泡，泵就不能正常工作，有时还会停止工作。安捷伦1100解决办法：打开Purge阀，用充分脱气的流动相以5ml/min速度冲洗管道。另外，流动相内溶有空气还会增加检测器的噪音，色谱图上出现毛刺。脱气方法：氨脱气、真空脱气、超声脱气、加热。加热回流是最有效的脱气方法，氨脱气法次之，超声脱气法效果

6、最差，只能除去30%的溶解气体。实际工作屮可联合使用两种方法，我们使用抽真空和超声相结合，可大大提高脱气效率。三、泵种类：螺旋柱塞泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。多用柱塞往复泵。主要由柱塞杆、密封垫圈和两个单向阀组成。密封垫圈包裹柱塞杆，是液相色谱系统中最易磨损的部件，需定期更换。单向阀：阀体是不锈钢的，内有宝石球，防止液体反向流动。工作原理：通常市电机带动凸轮转动，驱动柱塞杆在液缸内往复运动。吸液：柱塞杆rti泵腔内向外运动，进口单向阀打开，出口单向阀关闭，流动相口入口单向阀进入泵腔。排液：柱塞杆被推入泵腔，出口单向阀打开，进口单向阀关闭,流动和由泵腔流向色谱柱。低压混合

7、高压混合卩q、进样器六通进样阀和自动进样器六通进样阀：当阀处于装样（Load）位置时，定量环与进样孔和放空孔相连,用微量注射器将样品注入定量环，多余样品从放空孔排出。此时，流动相从泵直接入柱。将六通阀转子转动60°C处于进样（Inject）位置，此时定量环与泵和色谱柱相连，定量环内的样品由流动相带入色谱柱。扳动阀时，动作不能太慢，更不能停留在中间位置，这时流动相受阻，泵内压力剧增。当再转动阀到位吋，过高的压力冲击在柱头上会损坏柱子。关键部件是转子和定子。转子被磨损后，转子与定子不密封，会有流动相漏出，进样体积不准，此时需要更换转子。日常要