实验二 可溶性蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝G-250法)

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1、实验二植物组织中可溶性蛋白的测定实验目的植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。实验原理考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质与色

2、素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。实验器材和试剂实验仪器：分光光度计分析天平样品容量瓶移液管试管实验材料：植物叶片实验试剂标准牛血清蛋白溶液染料试剂G-250试剂的配制牛血清白蛋白配成1000μg/ml和100μg/ml；考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于5

3、0ml90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月；90%乙醇；磷酸（85%，W/V）。实验步骤1.标准曲线的绘制（1）0～100μg/ml标准曲线的制作取6支试管，按表-1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml试管中，加入3ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，混合均匀，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。表-1配制0～100μg/ml血清白蛋白液管号123456100μg

4、/ml牛血清蛋白量(ml)蒸馏水量(ml)蛋白质含量(mg)01.000.20.80.020.40.60.040.60.40.060.80.20.081.000.10实验步骤（2）0～1000μg/ml标准曲线的制作另取6支试管，按表28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤（1）操作相同，绘出0～1000μg/ml的标准曲线。表-2配制0～1000μg/ml血清蛋白血液管号7891011121000μg/ml牛血清白蛋白（ml）蒸馏水量(ml)蛋白质含量(mg)01.000.20

5、.80.20.40.60.40.60.40.60.80.20.81.001.0实验步骤2.样品提取液中蛋白质浓度的测定取植物叶片0.1-0.2剪碎，用磷酸缓冲液研磨，倒入10ml离心管中，定容到10ml，10000pm离心，20min得上清液作为待测样品。取0.5ml提取液于试管中，加入0.5ml蒸馏水后摇匀，再加上3ml考马斯亮兰试剂并充分摇匀，在30摄氏度水浴20min，于595nm处测得OD值。可溶性蛋白质含量的计算可溶性蛋白含量(μg/gFW)=标准曲线上查得的蛋白质量（μg）×10/（0.1或0.2

6、）示意如下：注意事项由于取的组织不同，所以OD值相差较大。研磨须充分，否则溶解后析光时所得数据并不是1克植物量对应值。标准溶液的测定实验组同时进行，以免引起误差。