实验三1.4发育

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1、实验三、小鼠胚胎的采集及其形态观察胚胎的采集是胚胎工程和动物发育生物学领域的一项基本技术。通过本实验内容，为进一步开展胚胎的体外培养、胚胎移植、胚胎的性别鉴定、胚胎分割等技术打下基础；通过本实验学习，掌握小鼠不同时期受精卵的采集方法及不同时期胚胎的形态特征；一、目的与意义哺乳动物卵由卵巢释放进入输卵管，在壶腹部受精并完成第二次减数分裂，开始缓慢的卵裂，通常12～24h完成一次，最初的几次卵裂是在输卵管完成，因此可以利用输卵管冲卵法获得2～8细胞期胚胎；卵裂的胚胎借助输卵管纤毛运动朝子宫方向迁移，大约在受精卵发育后第三天（桑椹胚

2、阶段）移行到子宫，并在子宫发育至囊胚后着床，因此子宫冲胚法适用于桑椹胚和囊胚的获得。二、实验原理哺乳动物旋转均裂（全卵裂）（海胆与家兔比较）细胞紧密化（compaction）（小鼠8细胞胚胎紧密化现象前后比较）胚胎的早期发育过程三、实验仪器与试剂药品1.仪器：实体显微镜、倒置显微镜、冲卵器、培养皿、滤纸、纱布、钟表镊、眼科剪、注射器、酒精棉等2.药品试剂：超排药物（PMSG和HCG）、PB1液、M16液、液体石蜡3.实验动物：性成熟的雄性和雌性小鼠1.实验动物的准备超排卵处理：选择性成熟的雌性小鼠，间隔48h依次腹腔内注射各

3、10单位PMSG和hCG；交配：在上述进行hCG处理的同时，与性成熟的雄性小鼠合笼交配，在第二天，雌性小鼠的阴道口见有阴道栓者判定为交配成功。用于下列实验。四、实验步骤将上述经过超排和交配过的雌性小鼠，在处理hCG后的38-48h，剖腹采取输卵管及与之相连的子宫和卵巢，并置于铺有灭菌滤纸的操作盘内。2.输卵管胚胎的采集通过输卵管可以采集2～8细胞期的胚胎。本实验主要介绍2-细胞期采集的方法。分离输卵管，并将其导入含有培养液的表面皿中.将分离的输卵管导入含有培养液的表面皿中输卵管灌流在实体显微镜下，用带有27-30G注射针的注射

4、器，通过输卵管腹腔口(伞部）或宫管连接部口，利用PB1溶液灌流输卵管，在实体显微镜下，观察灌流输卵管的灌流液，查找2-细胞期胚胎，将收集到2-细胞期胚胎用PB1溶液清洗2～3次后。移到盖有液体石蜡的培养皿内的液滴中；在实体显微镜下，观察收集到的2-细胞期胚胎形态，主要观察透明带、卵裂球的大小、极体及异常胚胎等。2细胞期胚胎的收集及其观察通过子宫灌流可以获得桑椹胚、囊胚和孵化囊胚，本实验主要介绍桑椹胚和囊胚的采集方法。将上述经过超排和交配过的雌性小鼠，在处理hCG后的96～120h，剖腹采取输卵管及与之相连的子宫和卵巢，并置于铺

5、有灭菌滤纸的操作盘内。3.子宫内胚胎的采集用眼科剪等仔细去掉子宫周围的脂肪，在切断输卵管的同时，切断子宫角和子宫体的连接部，使双侧子宫角分离为二，置于含有培养液的表面皿中子宫灌流准备含有操作液的1ml一次性注射器。用注射针，将上述处理后的单侧子宫角的宫管连接部的子宫端刺破，然后用注射器由子宫颈端向输卵管端灌流，灌流量约05～1.0ml。胚胎收集及观察在实体显微镜下，查找桑椹胚和囊胚。用移卵管将观察到胚胎，用PB1溶液清洗2～3次后，将其收集到盖有液体石蜡的培养皿内的液滴中；在实体显微镜（90－100倍）下，观察桑椹胚和囊胚的形

6、态，主要观察胚胎发育期的一致性，细胞的紧密、死亡细胞数、胚胎的亮度、透明带是否损伤等。1.掌握小鼠胚胎的采集方法；2.观察并绘制2-cell及4-cell的形态构造3.观察并绘制桑葚胚及囊胚的形态构造4.简述哺乳动物的卵裂特点五、要求