超分辨率显微技术浅谈

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1、超分辨率显微技术浅谈摘要：关键词：正文：超分辨率技术的原理：即通过硬件或软件的方法提高原有图像的分辨率，通过一系列低分辨率的图像来得到一幅高分辨率的图像过程就是超分辨率重建。超分辨率重建的核心思想就是用时间带宽（获取同一场景的多帧图像序列）换取空间分辨率，实现时间分辨率向空间分辨率的转换。二：超分辨率显微技术产生原因：传统光学显微镜受限于光的波长,无法对200nm以下的物体进行观测。电子显微镜虽然可以达到纳米级的分辨率，但通电的结果容易造成样品的破坏，因此能观测的样木也相当有限。蛋白质贴上荧光卷标得技术虽然己经较为成熟，但因为蛋白质大分子的理化特性使其容易堆积

2、，很难在显微镜下进行观察。因此急需一种可以对200750nm大小范围内的物体进行观察并且拥有较高的空间分辨率（20nm以下）的显微镜。三：三种显微技术的研究：1.超近场光学扫描（UNFOS）：2.超分辨率荧光显微技术（xy平面上的改进）：a.荧光显微镜和荧光显微技术：荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。荧光显微技术是应用短波光照射被测物质以激发其发射荧光从而在荧光显微镜下观察。b・单分子荧光成像:当显微镜需耍分辨两个或者更多点光源的

3、时候，很难突破光学分辨率的极限来进行精确定位。而当显微镜的物镜视野下仅有单个荧光分子的时候，通过特定的算法拟合，此荧光分子位置的精度可以很容易超过光学分辨率的极限，达到纳米级。在同样的信噪比图像上，用高斯函数拟合单分子荧光的点扩散函数可以达到最佳的定位精度.Thompson等科学家结合了理论推导和计算机模拟，综合考虑了各种因素的影响，如离散时间段检测到的发出光子数的泊松噪声、CCD相机的背景读岀噪声以及CCD像素点的大小等，得到了单分子在二维定位精度上的近似公式：其中x为定位的误差，s为点扩散函数的标准方差,a为CCD像素的大小，N为收集到的光子数，b为背景噪

4、声。c.PALM和STORM：尽管单分子的定位精度可以达到纳米级，但它并不能提高光学显微镜在分辨两个或者多个点光源时的分辨率。2006年9月，Betzig和Lippincott-Schwartz等在Science上提出了光激活定位显微技术(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM):是用PA-GFP来标记蛋白质,通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表曲，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子•在确定这些分子的位置后，再长时间使用488nm激光照

5、射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来.之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环.这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位.将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术，如图所示，PALM显微镜的分辨率仅仅受限于单分子成像的定位精度，理论上来说可以达到lnm的数量级。PALM的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质的定位无能为力.2006年底，美国霍华德・休斯研究所的华裔科学家庄晓薇实验组开发出

6、来一种类似于PALM的方法，可以用来研究细胞内源蛋白的超分辨率定位：随机光学重构显微技术（stochasticopticalreconstructionmicroscopy,STORM）:・将Cy3和Cy5分子对胶联到特异的蛋白质抗体上，就可以用抗体来标记细胞的内源蛋白.应用特定波长的激光来激活探针，然后应用另一个波长激光来观察、精确定位以及漂白荧光分子，此过程循环上百次后就可以得到最后的内源蛋白的高分辨率影像。d.STED（受激发射损耗显微技术）：用…束激发光使荧光物质（既可以是化学合成的染料也可以是荧光蛋白）发光的同时，用另外的高能量脉冲激光器发射一束紧挨

7、着的、环型的、波长较长的激光将第一束光斑中大部分的荧光物质通过受激发射损耗过程猝灭，从而减少荧光光点的衍射面积，显著地提高了显微镜的分辨率.STED成像技术的最大优点是可以快速地观察活细胞内实时变化的过程，因此在生命科学屮应用更加广泛e.SSIM（饱和结构照明显微技术）：将多重相互衍射的光束照射到样本上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息。1.扫描隧道显微镜：a.弱点:（1）.对观察样品限制较多，例如样品必须是导体，不能是非导体和溶液等；（2）.对样品环境有严格要求，如要求高真空等；（3）.对观察的对象都过多过少造成损害，而光学显微镜对样品的限制极少

8、，可以是非导体或液体,可以是有牛命的也