双钩异翅长蠹检疫鉴定方法

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1、SN中华人民共和国岀入境检验检疫行业标准SN/Txxxx一xxxx双钩异翅长蠹检疫鉴定方法DetectionandidentificationofHeterobostrychusaequalis(Waterhouse)(送审稿2013.11.24)XXXX发布XXXX-XX-XX实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布木标准依照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1821-2006《双钩异翅长歳检疫鉴定方法》，与SN/T1821-2006相比，主要技术变化如下：——在前言中增加了标准涉及专利的相关说明。——増加了规范性引用文件。——增加了RDB

2、术语定义。——修改了冃次的编排格式。——增加了双钩异翅长蠹的反向斑点杂交（RDB）检疫鉴定方法。——增加了资料性附录A双钩异翅长蠹的其它信息和异翅长蟲属种检索表。——修改了资料性附录A序号为资料性附录B,増加成虫与幼虫的彩图。——增加了规范性附录CRDB通用引物SF/SR、阳性质控质粒及探针序列。——增加了规范性附录D杂交液配置。请注意木文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。木标准起草单位：屮华人民共和国珠海岀入境检验检疫局、屮华人民共和国深圳岀入境检验检疫局。本标准主耍起草人：李冠雄、徐浪、余

3、道坚、黎财慧、李捷、张建军、喻国泉、鲍斐、陈伟琪。本标准代替了SN/T1821-2006o双钩异翅长蠹检疫鉴定方法1范围本标准规定了双钩界翅长蠹形态学和RDB检疫和鉴定方法。本标准适用于进出境木材、竹材、藤材或其制品、包装材料及运输工具中双钩异翅长就的检疫和鉴定，利用RDB法可准确鉴定双钩异翅长鑼的卵、幼虫、蛹和成虫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注H期的引用文件，仅所注H期的版木适用于木文件。凡是不注口期的引用文件，其最新版木(包括所有的修改单)适用于木文件。SN/T2039-2007地中海实蝇检疫鉴定方法一PCR法3术语和定义下列术语和定义

4、适用于木文件。RDBReversedotblot反向斑点杂交，一种基于PCR基础Z上的杂交技术。4双钩异翅长蠹基本信息学名:Heterobostrychusaequalis(Waterhouse)o界名:BostrichusaequiaisWaterhouse；BostrychusaequalisLcsnc；BostrychusimcipennisLesne；HeterostrychusaequalisLesne。分类地位：鞘翅bl(Coleoptera)长溢科(Bostrichidae)异翅长^Heterobostrychus^。传播途径：通过木竹藤料、制品和包装铺热材

5、料进行传播°全世界已知的长鑑科超过700种，界翅长蠹属已报道有6种:双钩界•翅长蠹H.aequalis(Waterhouse)；棕界翅长蠹H.Brunneus(Munay)；二突界翅长蠹H.hcunatipennis(Lcsnc)；白-角异翅长^H.pileatus(Lesne):额瘤异翅长unicornis(Waterhouse)和Hetcrobostrychusambigenus(Lesne)o双钩界翅长蠹的Jt它信息和界翅长蠹属种检索表参见附录A。5方法原理5.1形态学方法利用体视显微镜观察双钩界翅长蠹成虫、幼虫和蛹的形态学特征，主要根据成虫形态特征进行种类判定(参

6、见附录B)o5.2RDB方法根据昆虫mtDNACOI基因序列设计的长蟲科昆虫通用引物，对双钩异翅长蠹冃标棊因片段进行PCR扩增，获得带有生物素标记的PCR产物；再与预先人丄固化在EDC活化的尼龙膜（或硝酸纤维膜）上的特异性寡核昔酸探针杂交，通过肉眼观察RDB膜条上对应探针位点的显色反应进行结果判定。6仪器、用具和试剂6.1仪器和用具6」」形态学方法体视显微镜、锯、刀、银子、标签、解剖针、解剖刀、白塑料布、毛刷、指形管、养虫箱。6.1.2RDB方法高压灭菌锅、振荡水浴锅、水浴锅、烘箱、PCR仪、离心机、微虽:加样器、旋涡器、针式打印机、数码相机、扫描仪、pH计、滴定管、定容

7、瓶、天平（精度O.OOlg）,离心管（50mL^5mL、2mL、1.5mL、200pL）、滤纸等。6.2试剂6.2.1形态学方法75%乙醇、0.5%〜1%丙三醇。6.2.2RDB方法除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验川水应符合GB/T6682'

8、'—级水的规格。75%乙醇、无水乙醇、液氮、昆虫基因组DNA提取试剂盒、PCR缓冲液、dNTPs（dATP>dTTP、dCTP、dGTP）、TaqDNA聚合酶、1■乙基・3[3■（二甲氨基）内基]碳二亚胺（EDC）、EDC尼龙膜（或硝酸纤维膜）、TE缓冲液、20x标准柠檬酸盐（SS