动物免疫学实验指导

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1、第二版徐春厚谢为天雍艳红编动物医学生物技术专业用广东海洋大学教材科出版二00七年二月二十八日实验一凝集试验1实验二沉淀试验4实验三溶血试验8实验四病毒的血凝及血凝抑制试验10实验五E-玫塊花环试验13实验六EA玫瑰花环试验15实验七EAC玫瑰花环试验17实验八酶联免疫吸附试验18实验九荧光抗体技术20实验十多克隆抗体（免疫血清）的制备22实验一凝集试验颗粒性抗原（细菌、螺旋体、红细胞等）与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应（Agglutinationreaction）或凝集试验。参与凝集反应的抗原

2、称为凝集原（Agglutinogen）,抗体称为凝集素（Agglutinin）。细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，衣悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。抗原与和应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此吋已有•凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外而的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两人

3、类，木实验主要介绍直接凝集反应。［目的要求］1.掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。2.掌握凝集试验的结果判定及判定标准。1.熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。［材料与试剂］1.玻板，载玻片，试管（lcmx8cm）,试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。2.灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。3.布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（丫、羊或猪）。4.鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡H痢阴

4、性血清，被检鸡血清。［实验内容及操作方法］（一）试管凝集试验以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。1.试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为対照，作好标记，置试管架上。如被检血淸有多份，对照只需做1份。1.被检血清稀释：第1管加入2.3ml0.5%石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5ml0.5%石炭酸牛理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2ml,加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5ml弃之，再吸取0.5ml加入第2管屮，混匀后吸IfX0.5ml加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5ml（见表l-l）o该被检血清的稀释度分

5、别是1:12.5.1:25.1:50、1:100o2.对照管制作：第5管中加0.5%石炭酸生理盐水0.5ml,第6管加1:25稀释的布氏杆菌病阳性血m0.5ml,第7管加1:25稀释的布氏杆菌病阴性血淸0.5ml。3.加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原川0.5%石炭酸生理盐水作1:20稀释，每支试管加0.5mlo抗原（1：20）0.50.50.50.50.50.50.5试管巧1234567对照管绘终血淸稀释度1：251：501：1001：200阳性血淸抗原1：25阴性血淸1：25表1-1布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单位：ml）0.5%右炭酸牛•理盐水

6、2.30.50.5r0.5r0.5被检血清0.20.50.5、0.5-、0.5、0.5“弃0.5弃1・54.感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37°C温箱+4-10h,取出后置室温18-2仆（或37°C温箱12-14h,取出后置室温2-4h；或37°C温箱中22-24h取出），然后观察并记录结果。5.结果判定：判定结杲吋用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。++++：100%抗原凝集，上清液完全透明,菌体完全被凝集呈金状沉于管底,振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。+++

7、：75%抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体人部分被凝集沉于管底，振荡时情况如Ho（管底凝集物与100%凝集吋相同，只是上清液稍浑浊）。++：50%抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。+：25%抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。-：抗原完全耒凝集，上清液完全浑浊不透明，但rii于菌体的口然下沉，在管底中央出现规则的菌体口沉圜点，振荡后立即散开呈均匀混浊。1.判定标准：能使50%抗原凝集的血清最窩稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1:100,判为阳性，1:50

8、的凝集价判为疑似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1:50,判为阳性，1:25的凝集价判