分子生物学复习笔记

《分子生物学复习笔记》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、分子生物学复习笔记临床医学系1使用说明：本复习笔记是广州某医学院临床医学的分子生物学的笔记，内容主要是基因技术，本复习笔记绝对原创，供各位同学复习使用Jimmy2012年6月22、克隆载体——外源DNA被扩增重组DNA技术第一节、重组DNA技术的相关概念用于重组DNA技术的理想载体条件：①自主复制能力（一）DNA克隆②较多的拷贝数——易于与染色体DNA分离和提纯克隆：是指从同一个共同祖先无性③分子质量相对较少繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞④多个单一限制性内切酶位点或个体所组成的群体。⑤有一个或多个筛选比o既⑥遗传稳定性获取同一拷贝的过程——克隆

2、化第二节、重组DNA技术操作的基本过程（无性繁殖）分——分离目的基因技术水平：分子克隆（DNA克隆）切——限制酶切目的基因和载体细胞克隆接——拼接重组体个体克隆（动物或者植物）转——转入受体细胞筛——筛选重组体DNA克隆：是在体外将不同来源的特异基因或DNA片段插入病毒、质粒或者其他载体分子，构建重组DNA分子，然后将重组DNA导入到合适的受体细胞中，使其在受体细胞中扩增和繁殖（克隆），筛选出含有目的基因的转化子细胞，在进行扩增、提取获得大量同一DNA分子（DNA克隆）。因此DNA重组技术又称为DNA克隆。（二）目的基因进行DNA重组的目的：①分离获得足够

3、的特异基因或DNA序列，并且第三节、常用的工具酶改变其结构②获得感兴趣基因的表达产物（肽链、蛋白质）工具酶功能目的基因：限制性核识别特异序列，切割DNA是指待研究或应用的特定基因，亦酸内切酶即待克隆或表达的基因，又称为外源基因DNA连接催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟酶基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA目的基因的类型：切口封合或使两个DNA分子或片段①cDNA——编码序列连接②基因组DNA——一个细胞或生物体整套遗传信息所有的DA序列DNA聚合①合成双链cDNA分子或片段连接酶Ⅰ②缺口平移制作高比活探针（三）载体③DNA序列分析④填补3´末端1、表达载

4、体——外源DNA可转录翻译成多肽Klenow又名DNA聚合酶I大片段，具有完链片段整DNA聚合酶I的5¢®3¢聚合、3¢®5¢3——研究基因突变和诊断遗传性疾病外切活性，而无5¢®3¢外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3¢影响限制酶作用的因素末端标记等限制酶作用需要不同的反应条件反转录酶①合成cDNAe.gDNA底物纯度、DNA甲基化程度、DNA分子②替代DNA聚合酶I进行填补，标结构、酶切反应的温度时间和缓冲体系记或DNA序列分析二、DNA连接酶（缝纫针）多聚核苷催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸酸激酶化，或标记探针①T4噬菌体DNA连接酶末端转

5、移在3´羟基末端进行同质多聚物加尾——催化两个独立的双链DNA片段5’-P与3’2+酶-OH之间形成磷酸二酯键，由Mg作为辅助因子并ATP供能。底物可以是平末端或者粘性末碱性磷酸切除末端磷酸基端。酶②大肠杆菌DNA连接酶：不能催化平末端DNA+一、限制性核酸内切酶分子的连接，底物只能是粘性末端，由NAD供能识别DNA的特异序列，并在识别位点或周围切割双链DNA分子中磷酸二酯键的一类内切酶DNA来连接酶的应用：1、DNA重组技术连接酶分类——I、II、III2、DNA复制——结合复制叉上不连续性产生的（基因工程中常用II型限制酶）接口3、DNA损伤的修复、遗

6、传重组和DNA剪接中的作用特点缝合作用——回文结构（4到8个核苷酸组成的特定序列）影响DNA连接酶应用的因素：底物双链性质——平末端或粘性末端所得切口：平末端、粘性末端反应温度连接酶的用量限制性核酸内切酶切割DNA链后产生的DNA片ATP反应浓度段的大小取决与限制酶特异性切割位点在DNA载体分子和外源分子的比值链中出现的频率三、DNA聚合酶（DDDPorRDDP）同裂酶（异源同工酶）——来源不同的限制酶，但能识别相同序列。1.大肠杆菌DNA聚合酶I’’酶切割DNA位点和方式可以相同可以不同。①5→3聚合酶活性’’②5→3外切酶活性’’同尾酶③3→5外切酶活

7、性——识别序列不完全相同，但作用后产生相同的粘性末端2.Klenow片段’’①5→3聚合酶活性’’限制酶的应用：②3→5外切酶活性——绘制基因组DNA物理图谱——研究基因组DNA同源性3.TaqDNA聚合酶——切割基因组DNA（或者cDNA）构建基因组耐热（最佳反应温度70-75℃）’’文库（或者cDNA文库）①5→3聚合酶活性’’——筛选鉴定重组质粒②5→3外切酶活性——测定基因核苷酸序列42+对Mg浓度敏感，主要用于PCR和DNA测序反1.pBR322质粒载体：由一系列大肠杆菌质粒应DNA通过重组技术构建成，长度为4.36kba含有一个复制起始点ori

8、和复制调节信号，4.反转录酶（三种活性——RDDP、DDDP、RN