hxj血清清、球蛋白分离

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1、何肖娟hxj50701@163.com生物化学与分子生物学实验教学中心血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定2010年秋季学期内容实验目的1实验原理2实验材料3实验过程45注意事项2009年秋季学期2实验目的掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法了解柱层析技术2009年秋季学期3实验原理蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可

2、分离纯化各种蛋白质。2009年秋季学期4蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法蛋白质的理化性质常用的纯化方法分子质量透析、超滤凝胶层析★离心溶解度调整pH调整离子强度★降低介电常数电荷电泳★等电聚焦离子交换层析★特异结合部位亲和层析其他性质吸附层析液相层析气相层析2009年秋季学期5球蛋白12等电点4.885.065.065.126.85~7.3相对分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量清蛋白A2009年秋季学期61.粗提（

3、盐析法）由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。血清清蛋白球蛋白半饱和硫酸铵清蛋白不沉淀，上清球蛋白沉淀，蒸馏水溶解2009年秋季学期72.脱盐（凝胶层析）盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法。凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。2009年秋季学期8凝胶层析分离示意图2009年秋季学期9凝胶层析分离化合物示意图2009年秋季学期103.

4、纯化（离子交换层析）离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离R-SO3-H++Pr+R-SO3-Pr++H+阳离子交换阴离子交换R-N+R3OH-+Pr-R-N+R3Pr-+OH-2009年秋季学期110.06mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷清蛋白pI4.9，带负电荷多a、b球蛋白pI5.0～5.2，带负电荷少a、b球蛋白被洗脱,清蛋白仍被吸附0.02mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷清蛋白及a、b球蛋白的pI＜6.5，带负电荷g–球蛋白pI＞6.5

5、，带正电荷清蛋白及a、b球蛋白被层析柱吸附,g-球蛋白被洗脱0.3mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷缓冲液离子强度增加清蛋白被洗脱2009年秋季学期122009年秋季学期134.纯度鉴定（电泳）血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果2009年秋季学期14三、实验材料人血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液20%磺基水杨酸1%BaCl2溶液电泳仪、电泳槽2009年秋季学期15四、实验过程盐析（粗分离）葡聚糖凝胶层析（脱盐）DEAE纤维素离子交换层析（纯化）醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）2009年秋季学

6、期16用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,取血清0.8ml，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白）约0.8ml用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,凝胶柱层析除盐继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液(2ml)洗脱，流出液量约2ml磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液12d此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性继续用0.02mol/LNH4AC

7、缓冲液洗涤约2mlBaCl2检测SO42-阴性用2~3ml0.02mol/LNH4AC缓冲液再生平衡过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm）过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm）继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液洗脱，流出液量约2ml磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液12d此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性继续用0.02mol/LNH4AC缓冲液洗涤约2mlBaCl2检测SO42-阴性用2~3ml0.02mol/LNH4AC缓冲液再生平衡盐析操作流程离子交换柱层析纯化加样加样2009年秋季学期17

8、用1ml0.0６mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,离子交换柱层纯化除盐后收集的清蛋白用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,取浓度最高的1管作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）继续用