免疫组化操作方法简介

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1、免疫组化基本操作小新SP原理免疫组化实验基本原理免疫组化实验操作步骤切片脱蜡至蒸馏水或PBSPBS冲洗2min×3次，（如需抗原修复，可在此步后进）3%H2O2室温孵育10分钟。蒸馏水冲洗，PBS冲洗2min×3滴加一抗工作液，37℃孵育1.5~2h或4℃过夜。PBS冲洗，2min×3次滴加适当量的检测系统，37℃孵育15－30分钟PBS冲洗，2min×3次DAB显色剂显色自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水透明（如需要）、封片组织的前期处理组织固定烤片固定时间对染色的影响固定比较：Vimentin（V-9）中性福尔马林固定72小时中性福尔马林固定48小时固定时间较长的标本，可通

2、过加强修复增强染色效果取材后组织（1.0×1.4×0.4cm）推荐后固定时间4-18小时Ki67MIB1TonsilFix.4h.TonsilFix.168h.HIER:pH&timeCipH610MinCipH630MinTEpH910Min烤片的温度不宜过高烤片的时间不宜过长烤片的影响因素二个主要因素：烤片的温度和时间对组织内抗原的保存有一定的影响，尤其是细胞核阳性的抗原推荐烤片温度及时间68-70℃烤2-4小时烤片的影响因素抗原方式的选择及操作方法一抗的选择及稀释比检测系统的恰当匹配实验中需要注意的问题关键步骤：温度和时间的相关性修复液的pH值亦很重要抗原修复的主要方法

3、抗原热修复的主要影响因素：抗原热修复温度和时间的关系时间(分钟)100°C80°C60°C5×2+++--5×6+++++++-5×10-+++++-10小时--++MBI单克隆抗体免疫组化灵敏度实验抗原热修复的有效性=加热温度（T）×加热时间（t）高温可以缩短修复时间低温需要更长的修复时间某些蛋白（抗原）需要较低温度修复微波炉修复和高压锅修复的比较温度压力时间受热微波炉100°C1P15~20分钟不均匀高压锅120°C1.2P喷气2分钟均匀不同修复方式CD20的染色结果单克隆抗体CD20高压锅修复单克隆抗体CD20微波修复抗原热修复:pH值的影响pH6A：CD20B：Ki-

4、67C：HMB45D:MOC31pH8-9A稳定型抗体：pH值改变对实验结果影响不大B“V”型抗体：强酸强碱修复液效果好，但强酸条件下，细胞皱缩变形，影响观察C上升型抗体：修复液pH值越高，效果越好D下降型抗体：适用于酸性修复液四种类型的抗体抗原修复Calponin:用不同pH值修复液的实验结果高压修复：将修复液烧开后将切片放入高压锅中，然后盖好盖子，加上气压阀，继续加热。待喷汽后开始计时2.5分钟后停止加热，自然冷却。微波修复：将切片放入修复液中，然后将修复液烧开，此时降低火力持续20分钟。然后自然冷却。抗原热修复方式的推荐不修复热修复：微波、高压、水浴酶消化：胃酶、胰酶、

5、蛋白酶K、XXV酶双暴露：先热处理后酶消化or先酶消化后热处理选择最佳修复方式正确的克隆号适当的稀释度推荐4℃过夜，可以选择室温1.5－2h或37℃1h一抗的选择检测系统的选择针对不同的组织选择不同的二抗两步法原理单克隆抗体ChromograninA多克隆抗体ChromograninACgA多克隆与兔单抗比较针对不同组织选择不同的二抗对于肝脏、肾脏等生物素含量高的标本一定要选择非生物素的检测系统酶标二抗可以有效避免生物素的干扰并提高敏感性内源性生物素Polymer原理图PV-6000Polymer原理图PV-9000Ki-67CKPRCD56