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1、实用植物细胞器的分离一、叶绿体的分离：1.实验原理：采用差速离心法，利用不同颗粒的大小形状不同导致沉降速率不同，把叶绿体的颗粒沉降出来。2.实验材料及试剂：成熟的猪笼草、山梨醇、Tris、EDTA与β-巯基乙醇均为Amresco产品、细胞器分离缓冲液:300mmol/L山梨醇,50mmol/LTris-HCl(pH为8.0),5mmol/LEDTA(pH8.0),0.1%β-巯基乙醇(临用前加入)。3.实验器材：SG350C多功能食品料理机(上海天航电器有限公司),GL21M高速冷冻离心机及配套的2号角转头(湘仪集团)表1叶绿体分离试剂配置名称使用浓度配制体积从母液吸取体积母液浓度称取
2、g实际g母液体积备注山梨醇0.3mol/L100ml10ml3mol/L54.651100mLTris-HCl0.05mol/L0.05mol/L100mlpH8.0EDTA0.005mol/L100ml1ml0.5mol/L14.6124100mLpH8.0β-巯基乙醇0.1%100ml100ml0.1%0.1100ml蔗糖52%100ml100ml52%52100ml蔗糖30%100ml100ml30%30100mlEDTA0.025mol/L100ml100ml2.5mol/L73.062100mLpH8.8EDTA0.025mol/L100ml100ml2.5mol/L73.0
3、62100mLpH8.0计算过程：山梨醇：配制体积：100mL，浓度：3mol/L；分子量：182.17g/mol文档实用需要称取质量g:=100mL*3mol/L*182.17g/mol=0.1L*3mol/L*182.17g/mol=54.651gEDTA:配置体积：100ml,浓度：0.5mol/lL,分子量：292.248g/molm=0.5mol/L*100mL*292.248g/mol=14.6124gLEDTA:配置体积:100ml浓度：25mol/L,分子量：292.248g/molm=2.5mol/L*100mL*292.248g/mol=73.062g4.制备方法4
4、.1 叶绿体粗提物的制备（1）.取25g叶片置于100mL充分预冷的细胞器分离缓冲液中,用食品料理机匀浆2min(5000r/min),（2）.然后将匀浆液用4层纱布过滤于500ml烧杯,（3）.滤液于4℃、700g在1000r/min离心10min,（4）.弃去细胞核沉淀上清液再于4℃、2000g在3000r/min离心10min,所得沉淀即为叶绿体粗提物,（5）.将此粗提物悬浮于7.5mL细胞器分离缓冲液中备用。4.2 密度梯度离心制备完整叶绿体（1）.用50mL离心管制备蔗糖梯度,底部为18mL含52%(质量分数)的蔗糖,50mmol/LTris-HCl(pH为8.8),25mm
5、ol/LEDTA(pH为8.8)的混合液,上面用7mL含30%蔗糖、50mmol/LTris-HCl(pH为8.0)、25mmol/LEDTA(pH为8.0)的混合液覆盖。（2）.将上述所得叶绿体粗提取物小心覆盖于30%的蔗糖上面,平衡后在4℃、20kr/min离心30min。（3）.处于52%蔗糖与30%蔗糖界面上的绿色条带即为完整叶绿体。（4）.用加样枪小心吸出绿色的条带。5.叶绿体的显微鉴别：叶肉细胞中的叶绿体，散布于细胞质基质中，呈绿色，扁平的椭球形或球形可以在高倍显微镜（400~600）下观察到它的形态和分布。二、线粒体的分离1.实验原理：利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中
6、沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。文档实用2.实验材料及试剂：实验材料成熟的拟南芥，琼脂糖为杭州微生物试剂厂产品;牛血清蛋白(BSA)为上海试剂厂产品;DNase和RNase为上海生物工程技术服务有限公司产品;溴化乙锭为SerVa公司产品;其余试剂均为国产分析纯.1×TAE电泳缓冲液(称取242gTris溶于适量蒸馏水中,加入57.1mL冰乙酸,100mL0.5mol·L1EDTA,pH=8.0,用蒸馏水定容至1L即为50×TAE转换为1×TAE稀50倍)缓冲液A:蔗糖0.5mol·L-1,Tris-Cl50mmol·1,EDTA5mmol·L-
7、1,BSA0.1%,PVP0.5%,0.1%β-巯基乙醇,pH=7.5.缓冲液B:蔗糖0.5mol·L-1,Tris-Cl50mmol·L-1,pH=7.5.缓冲液C:蔗糖0.6mol·L-1,Tris-Cl10mmol·L-1,EDTA20mmol·L-1,pH=7.2.缓冲液D:0.1mol·L-1Tri-HCl(pH=8.0),0.05mol·L-1EDTA(pH=8.0),0.1mol·L1NaCl,10%SDS,0.01mol·L-1
