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《DB21∕T 2619-2016 传染性造血器官坏死病毒LAMP检测方法》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、ICS67.120.30B50DB21辽宁省地方标准DB21/T2619—2016传染性造血器官坏死病毒LAMP检测方法Loop-mediatedisothermalamplificationdetectionmethodforInfectioushaematopoieticnecrosisvirus2016-04-27发布2016-06-27实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2619—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准主要起草单位:辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人:肇慧君,胡强,张雪,刘钊,栾慎顺,
2、李叶,胡传伟。1DB21/T2619—2016传染性造血器官坏死病毒LAMP检测方法1范围本标准规定了传染性造血器官坏死病毒(Infectioushaematopoieticnecrosisvirus,IHNV)病原分离和环介导恒温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)检测方法。本标准适用于IHNV病原的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用
3、水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3符号代号和缩略语下列缩略语适用于本文件。CPE:细胞病变(cytopathiceffect)CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammoniumbromide)DEPC:焦炭酸乙二酯(diethypyrocarbonate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)HEPES:羟乙基呱嗪乙硫磺酸[4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonicaci
4、d]RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)LAMP:环介导恒温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification)Betaine:甜菜碱Bst酶:BstDNA聚合酶(大片段)[BstDNApolymerase(largefragment)]AMV逆转录酶:AMVreversetranscriptasedNTP:脱氧核糖苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)4试剂、仪器和耗材4.1试剂4.1.1引物选取特异性的IHNV的糖蛋白基因(G基因)的序列,设计出能专一性鉴别传染性造血器官坏死病毒的特异性引物组,该引物组由
5、如下四条引物组成:外引物1(F3):5′-ATCGCGCTACCAGCTTCA-3′2DB21/T2619—2016外引物2(B3):5′-TCATTGTAGAGGGCCAGGAT-3′内引物1(FIP):5′-GGTGGTGTTGTTTCCGTGCAATTTTTAATGGGAACGACCCTTTGG-3′内引物2(BIP):5′-GTCGCCCAGTACAAGATGAGCATTTTCTTGGATGGGGTACGGATTT-3′4.1.2BstDNApolymerase:8U/μL,-20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。4.1.3AMV逆转录酶:15U/μL,-20℃保存,不要反复
6、冻融或温度剧烈变化。4.1.42×reactionmixture:含40mMTris-HCL、20mM氯化钾溶液、20mM硫酸铵溶液、16mM硫酸镁溶液、0.2%Tween-20、1.6Mbetaine(甜菜碱)、2.8mMdNTPs。4.1.5Rnaseinhibitor:40U/μL。4.1.6显色液:浓度为1000×SYBRGreenⅠ。4.1.7阳性对照:IHNV参考株。4.1.8EPC细胞系:用M199培养液25℃培养。4.1.9FHM细胞系:用M199培养液25℃培养。4.1.10乙醇:分析纯,使用前预冷到-20℃。4.1.11氯仿:分析纯。4.2仪器与耗材4.2.1倒置显
7、微镜。4.2.2恒温培养箱。4.2.3普通冰箱和超低温冰箱。4.2.4组织研磨器(研磨器处理参见附录B)。4.2.5高速台式离心机:≥7000g。4.2.6水浴锅或加热模块:65℃+1℃和100℃+1℃。4.2.7移液器:量程0.5μL~10μL,量程10μL~100μL,量程100μL~1000μL。4.2.896孔细胞培养板。4.2.90.2mL和1.5mL塑料离心管。4.2.10吸头,配套移液器待用。4.2.11计时器。注:除非另有说明,
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