DB21∕T 2619-2016 传染性造血器官坏死病毒LAMP检测方法

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1、ICS67.120.30B50DB21辽宁省地方标准DB21/T2619—2016传染性造血器官坏死病毒LAMP检测方法Loop-mediatedisothermalamplificationdetectionmethodforInfectioushaematopoieticnecrosisvirus2016-04-27发布2016-06-27实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2619—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准主要起草单位：辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：肇慧君，胡强，张雪，刘钊，栾慎顺，

2、李叶，胡传伟。1DB21/T2619—2016传染性造血器官坏死病毒LAMP检测方法1范围本标准规定了传染性造血器官坏死病毒(Infectioushaematopoieticnecrosisvirus，IHNV）病原分离和环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）检测方法。本标准适用于IHNV病原的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用

3、水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3符号代号和缩略语下列缩略语适用于本文件。CPE：细胞病变(cytopathiceffect)CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammoniumbromide）DEPC：焦炭酸乙二酯（diethypyrocarbonate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）HEPES：羟乙基呱嗪乙硫磺酸[4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonicaci

4、d]RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）LAMP：环介导恒温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification）Betaine：甜菜碱Bst酶：BstDNA聚合酶（大片段）[BstDNApolymerase(largefragment)]AMV逆转录酶：AMVreversetranscriptasedNTP：脱氧核糖苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）4试剂、仪器和耗材4.1试剂4.1.1引物选取特异性的IHNV的糖蛋白基因（G基因）的序列，设计出能专一性鉴别传染性造血器官坏死病毒的特异性引物组，该引物组由

5、如下四条引物组成：外引物1（F3）：5′-ATCGCGCTACCAGCTTCA-3′2DB21/T2619—2016外引物2（B3）：5′-TCATTGTAGAGGGCCAGGAT-3′内引物1（FIP）：5′-GGTGGTGTTGTTTCCGTGCAATTTTTAATGGGAACGACCCTTTGG-3′内引物2（BIP）：5′-GTCGCCCAGTACAAGATGAGCATTTTCTTGGATGGGGTACGGATTT-3′4.1.2BstDNApolymerase：8U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4.1.3AMV逆转录酶：15U/μL，-20℃保存，不要反复

6、冻融或温度剧烈变化。4.1.42×reactionmixture：含40mMTris-HCL、20mM氯化钾溶液、20mM硫酸铵溶液、16mM硫酸镁溶液、0.2%Tween-20、1.6Mbetaine（甜菜碱）、2.8mMdNTPs。4.1.5Rnaseinhibitor：40U/μL。4.1.6显色液：浓度为1000×SYBRGreenⅠ。4.1.7阳性对照：IHNV参考株。4.1.8EPC细胞系：用M199培养液25℃培养。4.1.9FHM细胞系：用M199培养液25℃培养。4.1.10乙醇：分析纯，使用前预冷到-20℃。4.1.11氯仿：分析纯。4.2仪器与耗材4.2.1倒置显

7、微镜。4.2.2恒温培养箱。4.2.3普通冰箱和超低温冰箱。4.2.4组织研磨器（研磨器处理参见附录B）。4.2.5高速台式离心机：≥7000g。4.2.6水浴锅或加热模块：65℃+1℃和100℃+1℃。4.2.7移液器：量程0.5μL～10μL，量程10μL～100μL，量程100μL～1000μL。4.2.896孔细胞培养板。4.2.90.2mL和1.5mL塑料离心管。4.2.10吸头，配套移液器待用。4.2.11计时器。注：除非另有说明，