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1、实验三高效液相色谱法测定黄酮类化合物一实验目的拿握高效液相色谱法测定橙皮昔、橙皮素单糖昔和橙皮素；了解高效液相色谱仪的使用。二实验原理1.高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC),以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装冇固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。高效液相色谱法具有高压、高速、高效、高灵墩度、应用范围广等特点。2.黄酮类化合物是指以2■苯基色原酮为母核的一类化合物。橙皮甘、橙皮素单糖甘和
2、橙皮素的结构见下图，这些化合物在284nm紫外光下有吸收。橙皮昔在鼠李糖昔酶作用下去除鼠李糖基得到橙皮索单糖昔，橙皮索单糖昔在卩■糖昔酶作用下去除葡萄糖基得到橙皮素。三实验试剂流动相：60%(v/v)甲醇，超纯水配置。使用前，流动相务必利用超声脱气30分钟。橙皮素；0.2%(w/v)橙皮营经鼠李糖苜酶水解10、20、30min后的产物。四实验器材色谱柱:WelchromC18,4.6x250mm,5micron。；样品瓶及样品垫。仪器：WatersHPLC；Waters1525BinaryHPLCPump；Waters2489UV/visibleDetec
3、tor；Waters2707Autosampler。五实验步骤1.开机打开电脑的电源；打开HPLC泵、柱箱、检测器和自动进样器的电源，紫外/可见检测器的自检需要5分钟。在电脑桌面上点击"breeze"图标，进入工作站。输入用户名，选“HPLC”,开始初始化，直至连接系统。2.方法的编辑在操作页面，点击“调用方法组编辑器导向”。点击“新建”，在弹出页面上点击柱箱图标，输入温度为25度；点击检测器图标，设定波长为284mm进样设置为默认；点击泵图标，压力上限应为4000psi,选择泵B,设定流速为lml/mino设定完毕后，给编辑的分析方法命名并保存。在操作页
4、而，点击“调用方法组编辑器导向”，调用所保存及命名的方法。1.管路除气泡打开泵的面板，将控制流向的阀转向“流动相不流经柱了”的状态，点击“平衡/监视”图标，启动泵，观察管路里的气泡，泵运行直至气泡完全去除。点击“取消运行”，停止泵。2.考察基线点击“平衡/监视”图标，启动泵，运行直至基线水平，观察压力值大小以及是否稳定（应约为2380psi）。3.编辑序列在页面上方的工具条中，点击“编辑”，点击“样品板”图标，弹出的对话框选“否”,设定样品板类型为ANSI-48vial2mlHolder,板位置为“1”。在样品队列中输入样品位置信息、样品名称以及进样量（1
5、0卩1）,其它参数为默认。4.运行和数据分析点击“运行”图标，在弹出框中输入样品组名称，点击“确定”,HPLC开始自动进样分析。分析结束后，点击“数据查询”，选择样品组名称，点击样品名称，页而会显示图谱。点击“积分”图标，页而会显示岀峰时间和峰而积等信息。5.关机点击“平衡/监视”图标，启动泵，运行直至基线水平。退出工作站。关闭电脑。关闭泵、柱箱、检测器和自动进样器的电源。做好仪器使用记录。六实验结果1.以酶水解时间（10、20和30min）为横坐标，橙皮昔和橙皮索单糖昔的积分峰面积为纵坐标作柱形图，描述0.2%橙皮苜在鼠李糖莒酶作用卜•的水解过程（注意该
6、过程屮冇无橙皮素产生）。橙皮甘，出峰时间3.844分钟,峰面积5210623微伏•秒。橙皮素单糖昔，出峰时间4.217分钟,峰而积2585915微伏•秒。橙皮昔，出峰时间3.838分钟,峰面积3654052微伏•秒。橙皮素单糖昔，出峰时间4.212分钟,峰而积3567114微伏•秒。I橙皮昔，出峰时间3.833分钟，峰面积2438164微伏•秒。橙皮素单糖营，出峰时间4.205分钟,峰面积1663962微伏•秒。凹丽{¥£1勾40B•issrtr:roeU£SJitr—nrtM3«1菸_汪>0菸邑>宾?:推>宝聖__京一0.2雇皮昔在鼠李糖昔酶作用下的水解
7、酶水解时间□橙皮昔■橙皮素单糖昔由图表可得，随着酶水解吋间的增加，橙皮昔的含量逐渐减少，橙皮素单糖昔的含量逐渐增多。但是第三个柱形图却与应该有的结果相反，可能是曲于时间过长，橙皮索单糖昔也分解了1.Waters2489检测器的检测池光程为lcm,根据284nm下的紫外吸收值，估算橙皮昔的摩尔消光系数。橙皮昔，出峰时间3.870分钟,峰高,0.018067o比面积,0.4541根据朗伯比尔定律，A=£be—e=A/bc已知A=0.018067,b=1cm,c=0.002mol/L可得e=9.0335001.最小检测信号为0.0001吸光值，估算所建立方法的最
8、小检测量。A=0.0001,c=A/ebc=6*10_,0inol
