棉花后代群体筛选方式分析

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1、棉花后代群体筛选方式分析转基因植株的筛选鉴定是植物转基因研究的重要环节。目前，转基因棉花筛选鉴定的常用方法为卡那霉素筛选法和PcR分子检测法［1—2］。针对不同试验F1的，这两种方法相关报道的文献较多，但都有较强的针对性，在实际转基因棉花育种过程屮，这两种方法的应用均存在弊端。卡那霉索筛选法不能反映冃的棊因的表达效果，英筛选结果缺乏可靠性。PCR分子检测法対试验室要求严格，检测费用昂贵，检测周期长。此外，转基因克隆研究的发展迅速，不断岀现新的抗虫基因、抗旱基因、抗病基因［3］,通过外源目的基因表达,而进行

2、生物测定的筛选方法各不相同，过程复杂，筛选缓慢。特别是近年，随着人规模转基因研究的相继开展，传统的筛选方法已无法满足大规模转基因后代的高效筛选，尤其是在转某因杂交育种中，需要在开花前得到准确筛选结果，以便育种操作，传统的筛选方法在效率上尚略显不足。因此，探索-•种快速，准确、较为系统的筛选方法，进行大规模转基因棉花示代群体的筛选显得尤为重要。木试验结合我国棉花转基因冇种屮的两个主流方法［4—5］,以花粉管导入［6］外源基因自交系T1—T3、转基因杂交育种F1种子为材料，探讨田间卡那霉索筛选与PCR分子鉴定

3、相结合,应对大规模转基因棉花后代筛选的可靠性和实用性，为转皋因棉花后代的筛选鉴定提供参考。1材料与方法1.1材料供试品种为绿色棉陇绿棉3号、白色棉陇棉2号、棕色棉BC05,均由卄肃省农科院作物所棉花研究室选育、提供，具冇纤维品质优良、产虽稳定等突出性状［7一8］。转基因鉴定的供试材料为：①通过花粉管通道法对陇绿棉3号、BC05导入抗虫基因GNA、抗旱基因GhABF2的Tl—T3；②WBK09.20090713-1979分别与陇绿棉3号、EC05、陇棉2号杂交F1（GNA、GhABF2的基因质粒、引物序列由

4、屮国农科院生物技术研究所提供；WBK09含Bt抗虫基因，材料和引物序列均由中国农科院生物技术研究所提供；20090713-1979含BADH抗旱基因，材料和引物序列由新疆农业人学农学院提供），花粉管导入T1-T3材料为海南、敦煌两地繁育所得，WBK09.20090713-1979与供试品种杂交F1由海南育种所得。GNA、GhABF2的基因质粒与WBK09、20090713-1979均携带NPTII标记基因（新霉素磷酸转移酶基因），该基因是目前基因工程屮被广泛使用的选择标记，它对植物细胞表现毒性的机理是：卡

5、那霉素干扰了细胞叶绿体及线粒体的蛋白质合成，最终导致植物细胞死亡，而转基因植株抑制了这个过程［9一10］。供试材料种植于卄肃省敦煌市肃州镇隔离试验区。分了鉴定地点为卄肃省农科院生物技术研究所棊因工程研究索。1•2方法1・2.1卡那霉素浓度梯度试验。设置卡那霉索3.OgL—1、5.OgL—1、7.0gL-1三个处理浓度，在棉花现蕾期，对供试品种顶端倒数笫2片真叶用毛笔涂抹药液，各处理50株，以WBK09做对照（经过PCR分了检测，携带NPTJI标记基因）,3〜5d观察统计结果。1.2.2卡那霉索抗性植株筛选

6、。在卡那霉素浓度梯度试验的基础上，对转基因供试材料进行卡那霉索筛选，对筛选后的阳性植株做标记，以备PCR分子检测。1.2.3PCR分子检测。剪取阳性植株顶端较嫩叶片，采用改良的CTAB大量提取法［11］提取纯化基因纟RDNA,针对阳性植株所含不同基因，利用设计好的引物（表1）进行PCR检测。PCR体系所用药剂为Fermentas公司生产，釆用引物由Invitrogen公司合成，统计检测结果。2结果与分析2.1不同品种敏感性及R那霉素筛选条件的确定根据口间观察结果，对棉叶与卡那霉索处理反应的表现分为三个等级

7、，I级：涂抹叶片正常；I【级：涂抹叶片有轻微变黄；III级：涂抹叶片具冇黄色斑点（图1）,为了得到可靠的卡那霉索筛选结果，消除棉花叶片自身对卡那霉素貝有抗性的试验影响，以III级处理结果作为卡那霉素筛选标准。在该筛选标准下，对试验结果进行统计，结果表明：三种浓度的卡那霉素棉叶涂抹，3〜5d内，均使陇棉2号、陇绿棉3号、BC05的棉叶百分Z百转变为具有黄色斑点的叶片；对照WBK09经过浓度为7.0gL—1卡那需素棉叶涂抹，在3〜5d内，叶片仍未变化。该结果表明，3.0〜7.OgL—1卡那霉素叶片涂抹，可以明

8、显区分转基因与非转基因植株。此外，参试品种在5.0gL-1卡那霉素叶片涂抹处理下，百分之市转变为具有黄色斑点叶片，陇棉2号需要3d,BC05需要4d,而陇绿棉3号需要5d；因此，可以认为，陇棉2号棉叶对卡那霉素最为敏感，BC05次Z,陇绿棉3号棉叶为卡那霉素反应最为迟缓。在保证准确性的前捉卜，为了快速得到筛选结果,可以确定陇棉2号的最佳筛选条件为5.0gL-1卡那霉素叶片涂抹，0〜3d观察期；BC05的最佳筛选条件为5.0gL