浅谈原核表达的技巧

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1、浅谈原核表达的技巧摘要：原核表达是表达外源基I人1常用的方法，具有操作简单、快捷，需时较短，表达产量高，适合工业化等优点。木文作者根据自己的实践经验，总结了原核表达的一些技巧。关键词：原核表达表达载体限制性内切酶将植物、动物、微生物等的目的基因插入合适载体片导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法-般称为原核表达。这种方法在蛋片纯化、定位及功能分析等方而都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下优点：易于生长和控制；易于培养，实验耗费少；可选择多种大肠杆菌菌株及与Z匹配的具各种特性的质粒。原核表达是近年来表达外源蛋口常用的方法，木文根据

2、自己的实践经验，着重谈谈对原核表达中的技巧问题。一、原核表达一般程序表达前准备■获得H的基因■构建含H的片段的表达载体（测序验证）•转化表达宿主菌•诱导靶蛋白的表达■表达蛋白的分析。二、原核表达中各操作步骤的关键因索及技巧1•表达前的准备要素：原核表达注重表达前对目的片段、表达载体及表达菌株的分析、选择。正所谓“磨刀不误砍柴功”，经过细致、周全的分析、准备、设计可带来较为顺当的实验，可免去许多不必要的麻烦。（1）对表达载体的分析载体的选择：同样的载体，同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量起高，但另外一个就是做不出来，所以表达载体的

3、选择非常重要,没有万能的载体。选择载体通常我们关心质粒上的儿个功能组件及所带來的问题:是否为诱导表达型载体，启动子的强弱、多克隆位点、限制性内切酶的位置、终止密码子的有无及位置，融合Tag的冇无,筛选报告基因的位置等。所选载体一定要保持原来的遗传背呆（有些载体经过多次交换已变异）。选择表达载体时,要根据所表达蛋白的最终应用考虑，如杲为了方便纯化，可选择融合表达；如果为了获得天然蛋白，可选择卄•融合表达。融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时,对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生T扰。翻译的起始位点：要表达冃的蛋白，在该

4、基因的亍端必须有一起始位点，现在大部分的表达载体都提供起始位点，起始密码子与核糖体结合位点的距离都已被优化，一般悄况下不需要自己再加，实际操作时要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子，如无，还得根据自己的实际情况加上。在起始密码子附近的rnRNA-级结构:外源基因英始转录后,保持niRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键，尤其是在起始密码子附近的rnRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产牛不完全的蛋白。如果利用PrimerPremier软件分析DNA或RNA结构上有柄（stem）结构，

5、并H结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定，影响正常的翻译。（2）对目的片段的分析基因（或蛋白）的人小：原核表达的成功与否与所耍表达的蛋门（或基因）人小有关，一般说来小于5kD或者大于lOOkD的蛋白都是难以表达的。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解。在这种情况下可以采取串联表达,在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。如果蛋白较大，大于60kD的贵口

6、建议使用较小的标签（如6x组氨酸标签）。对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。当然表达时耍根据H的进行截取，如果是耍进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部位抗原性较强。对于抗原性也可以利用软件分析，比如VeclorNITSuite或者一些在线软件，不过在分析之余也要认识到这是一•种资料统计的结论,如果蛋白和免疫动物亲缘关系较远的话述是不妨一试的。表达序列的GC含量：表达序列中的GC含量超过70%的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。GC含量可以利用DNASTAR、VectorNTISuite等软件进行预测。亲疏水性：

7、经常做表达的人都发现表达亲水区域时表达量会比较高，如果你耍表达一个膜蛋口，它的疏性会增加实验难度。有许多软件可以对氨基酸的亲疏水性进行分析，比如VectorNITSuite,除此之外还可以利用在线跨膜区预测软件对跨膜区进行预测。2.获得目的基因基因工程中，H的基因的制备有直接分离法、构建基因组文库分离法，构建cDNA基因文库分离法、聚合酶链式反应扩增法（PCR）和化学合成法。原核表达一般都是利用PCR把目的基因克隆扩增出來。PCR法的关键是设汁引物，可以使用两个软件，PrimerPremier或者Oligo來分析。如果要表达全长，

8、用不着考虑太多，从一头尾找至少8个匹配序列在加上与载体匹配的序列就行。注意以下儿点：、先查查表达外源片段中含冇什么内切酶位点，否则设计巫了，酚切后电泳就会老发现冇预期外的小片段出现。根据载体上的酚切位点设计引物，现在许多类似T载原理的克隆方法也可以