鸡传染性法氏囊的诊断技术

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1、鸡传染性法氏囊的诊断技术前§鸡传染性法氏囊病(IBD)是由TBDV引起的一种主要危害雏鸡的免疫抑制性传染病。本病1957年首先在美国特拉华州岗博罗(Gumboro)的肉鸡群中发现的，故又称岗博罗病(Gumborodisease)o根据本病有肾小管变性等严重的肾脏病变，曾命名为“禽肾病”。又因该病主要以损伤鸡免疫器官法氏囊为主，1970年为避免一病多名引起的混乱，统一称之为鸡传染性法氏囊病。本标准是参考OTE《诊断试验和疫苗标准手册》，并结合我国现有动物T生法规、农业部对传染性法氏囊的相关政策和措施及河欣科技中心试验条件制定的。1范围本标准制定了传染性法氏囊的病毒分离

2、、鉴定技术，病毒中和试验(VNT)、琼脂凝胶免疫扩散(AGTD)试验、酶联免疫吸附试验(间接ELTSA).PCR的技术要求。2病毒分离与鉴定技术2.1材料准备2.1.1病料的采取及处理病料的采取病毒分离的病料应采自发病早期典型的病例，病程较长的家禽不宜用于分离病毒。病禽扑杀后应以无菌操作法解剖尸体和采取病料，不同传染病所采病料不同，最好的检验病料为气管黏膜、肺、脑组织，应优先采集。高热期的血液中也有较高病毒含量。另外，脾、肝、肾和骨髓也nJ做为病毒分离的材料。1.2病料处理按1克组织加入5〜10毫升灭菌生理盐水进行研磨。每毫升研磨液中加入青療素和链每素各2000单位

3、，置4°C冰箱作用2〜4小时或37°C处理1小时后，以1500转/分钟离心15分钟，取上清液作为接种材料。2.1.3无菌检验对接种材料应作无菌检验。接种营养肉汤或血液琼脂平板，观察有无细菌生长。如有细菌，则应对材料进行滤过除菌或加入敏感抗菌药物处理。2.2病毒分离3..2.1鸡胚选择与孵化鸡胚应选择健康鸡群所产新鲜受精蛋，蛋的颜色以白壳蛋为好，照蛋时易于观察。孵化温度以37.5°C,湿度60%左右为宜。每天翻蛋3〜4次，注意放蛋时应人头朝上，鸡胚接种口龄因分离繁殖的病毒特征不同在6〜12日之间。2..2.2接种前准备与接种根据接种目的和分离的病毒特性不同，鸡胚接种分

4、为绒毛尿囊腔内接种、卵黄囊接种、绒毛冰囊膜接种和羊膜腔接种等方法。接种材料应确认无菌。经照蛋后画出气室和鸡胚位置，先用碘酒棉球、斤用酒精棉球涂擦消毒接种位置及其周围。以绒毛尿囊腔内接种为例，接种位置一般选在气室边缘上3毫米处，在该部位打孔，用1毫升或2.5毫升灭菌注射器吸取处理后的病料，插入气室下部小孔约5〜10毫米，每胚注射0.1〜0.2毫升，然后用融化的石蜡将蛋壳小孔封闭。2.3接种后检查接种后每隔6小时照蛋一次，24小时内死亡鸡胚应丢弃并做无害化处理。24小时后死亡鸡胚连同72小时未死亡鸡胚，置4°C经6〜12小时后取出收获材料，同时检查鸡胚病变情况。6.2.

5、4鸡胚材料收获一般悄况，接种部位即为收获材料的部位。來囊腔接种者,无菌收取丿求囊液；羊膜腔接种者，在先收取绒毛丿求囊液后再用注射器吸取羊水；卵黄囊接种者，先收取尿囊液和羊水厉再收取卵黄液。以上收获物应作无菌检验,防止细菌污染。2.3病毒鉴定2.3.1法氏囊病毒的特异性鉴雄：样品接种鸡胚后，若鸡胚丿求囊液没有凝血性,可用没有血凝性的鸡胚的绒毛尿囊液制备抗原，与法氏囊病毒标准阳性血清进行AGTD试验，检测样品中是否含有法氏囊病毒。2.3.2.1抗原的制备：从没有凝血活性的鸡胚中取岀绒毛丿求囊液，以1000r/inir)离心10分钟后取上清，按终浓度0.1%的量加入甲醛溶

6、液，置37°C温箱灭活36h做灭活检验后即可作为AGTD试验用抗原。3琼脂凝胶免疫扩散(AGID)试验3.1材料准备7.1.1硫柳汞溶液、PH值7.2,0.01mol/LPBS溶液,配制见附录A3.1.2琼脂板：制备方法见附录B3.1.3法氏囊琼脂凝胶免疫扩散抗原、标准阴性血清和阳性血清。2操作方法1打孔：在制备的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔(中间1孑L,周围6孔)，孔径约5mm。孔距2mm-5mm,将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插入，轻轻向左方向将琼脂挑出，勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。3.2.2封底：用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要融化为止，封闭孔的底

7、部，以防侧漏。3.2.3加样：用微量移液器或带有6-7号针头的0.25ML注射器，吸取抗原悬液滴入中间孔，标准阳性血清分别加入外周1、4孔中，被检血清按编码顺序分别加入另外4个外周孔，每孔均以加满不溢出为度，没加一个样品换一个滴头。3.2.4作用：加样完毕片，静置5min-10min,然后将平皿轻轻倒置放入湿盒内，37°C温箱中作用，分别在24h、48h、72h观察并记录结果。3.3结果判定2..3.1判定方法将琼脂板置口光灯或侧强光下观察，若标准阳性血清与抗原孔Z间出现一条清晰的口色沉淀线，则实验成立。3..3.2判定标准1若被检血清孔与中心孔抗原Z间出现清晰