研究报告--干扰素

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1、研一、HUS细胞会藉市一些防御机转来保护自身免丁•病毒的侵入，而干扰1(interferon,INF)Wantiviraleffect>antiproliferation2^immunomodulatoryproperties彳艮右.关系。INF主耍有2种type,typeI的INF包含INF・(x、INF■卩、INF-co；typeII即为INF-yo其中，细胞被病毒入侵后，会刺激细胞内typeIINF(INF-a/p)的生成，因此typeIINF又被称为viralINF,大多数的细胞皆可制造INF-a/p；而typeIIINF(INF-y)只有细胞在m

2、itogenic或antigenic的情况下才会被活化，又称为immuneINF,因此也只有免疫系统的细胞才会制造，如自然杀手细胞、CD4Thl细胞及CD8cytotoxicsupressor细胞。病毒藉rfl与细胞表面特定受器接和进入细胞的过程中，会活化NF・kB、ATF-2/c-Jun>interferonregulatoryfactors(IRFs)及INF-a/卩本身，进而刺激INF大量生成。INF可活化下游抑制病毒(antiviraleffect)dsRNA生成的蛋白质，如proteinkinase(PKR)、29-5"-oligoadenyla

3、tesynthase(OAS)>RNaseL及MxproteinGTPase,以对RNA病毒的复制程序进行阻碍。而对某些DNA病毒而言，因为病毒木身不产生dsRNA,因此，INF对此类病毒有另外一套的抑制机制，进而保护自身及周遭健康细胞免于病毒的残害。FtlINF所架构的防御机转，确实替细胞逐出一道最佳防线，但是在基因治疗的策略中，却显绊脚。不管在短期或长期，体内或体外的实验中，转殖基因的表现确实会受到这些细胞激素(cytokines),如INF、TNF・a、IL的影响，其中绝人多数是负面的效果。文献指出，cytokines并非以促使受感染细胞本身蛋白质表

4、现异常、引起细胞凋广机制，或采分解这些外来基因、阻止病毒进入等方式来抑制转殖基因的农现，而是透过调控启动子的活性以降低病毒基因(转殖基因)转录形成RNA的过程。已有许多文献指出，这些cytokines具有抑制CMV启动子的机制，其中INF-a藉由降低NF-kB的活性而抑制CMV启动子。已有许多研究团队针对杆状病毒是否诱发哺乳动物细胞产生免疫机制进行详尽的分析。一部份学者认为，病毒套膜上的gp64及gp67与细胞结合后，会刺激细胞的免疫反应；也有学者提出是病毒DNA在内化的过程中与Toll-likereceptor9(TLR9)作用而引起免疫反应。尽管说法不

5、一，但却证实杆状病毒确实会引起哺乳动物细胞产生cytokies,如interfbma/p>TNF-a.IL-la>IL■卩、IL-6及IL-12等，这些cytokines是免疫、发炎或抑制病毒机制启动初期的重要讯号传递物质。在木研究中以CMV作为启动子，如前所述，cytokines对CMV具有严重的影响；此外，在添加丁酸钠盐后，确实可有效提高杆状病毒的转导效率，正说明了转殖基因在细胞内可能受到病毒转导后所诱发的抑制病毒反应抑制。在此研究中，将针对软骨细胞经杆状病毒转导后，是否活化此类cytokines,而这些cytokines是否阻碍初期转导及重复转导中转

6、殖基因表现效率的良莠。二、材料与方法:杆状病毒之放大与纯化1.昆虫细胞及培养基在木研究中，昆虫细胞Spodopterafrugiperda仅用丁重组杆状病毒的放人及测定病毒PFU值(plaque-formingunits)<>细胞培养期间，以添加10%胎牛血清(FBS,Invritogen)之TNM-FH(Sigma)作为其培养基并培养于培养盘中,培养盘置于27°C,5%CO2之恒温培养箱中并控制其细胞密度。2.重组杆状病毒之建构此研究所用之杆状病毒rh松蒲教授的实验室所建构完成。简言之，病毒载体乃由市售之pFastBac-DUAL质体为架构，将绿色荧光蛋

7、白基因接TCAG启动子(acombinationofchickenbeta-actinpromoterandcytomegalovirusimmediate-earlyenhancer)之后，并以AcMNPVCAGGFP命名之。3.杆状病毒之放大及有效价数测定我们将昆虫细胞种丁培养盘后，加入multiplicityofinfection(MOI,定义为pfu/cell,其中pfu指的是plaqueformingunits,为测量病毒感染力的单位)为0.01之杆状病毒。感染3〜4天之后，观察细胞的存活率。因杆状病毒会使昆虫细胞产生溶裂而将衍生之病毒子代释放丁

8、•培养基中，当细胞存活率达60-70%吋，收集溶液并以4000rp