几种MIC的测定 方法

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1、几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）的方法1浊度法1.1常量肉汤稀释法 （试管）1.1.1.抗菌药物贮存液制备 将抗菌肽稀释到无菌水中，制成1024μg/ml的原液，（也可以用0.22um滤膜进行过滤，但要去掉前面5ml的过滤抗菌肽溶液）。抗菌药物贮存液浓度按照不同梯度稀释。1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 1.1.3. 培养基 推荐使用LB肉汤培养基，pH7.0~7.4。指示菌为大肠杆菌或沙门氏菌。 1.1.4.接种物的制备 有2种方法配制接种物，一是细菌生

2、长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的LB肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或LB肉汤培养基校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用LB肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。 1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlL

3、B肉汤外，其余每管加入LB肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1024μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。 （注：在稀释的

4、过程中，每次吸取1ml到下一管中后，要换掉枪头，后面的方法相同）1.1.6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置37℃摇床培养16~20h。 1.1.7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。或者用分光光度计测定OD600，与未接菌的比对，判断耐药（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。1.2.微

5、量肉汤稀释法  （酶标板）1.2.1.抗菌药物和培养基制备 同常量肉汤稀释法。 1.2.2.MIC板制备 无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，药物浓度分别为1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/ml。 第12孔不加药作为生长对照，如果当时不使用，则冰冻干燥后密封，-20℃以下保存备用。 1.2.3.接种物制备 将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经LB肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加90μl，密封后置

6、37℃摇床孵育16~20h判断结果。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。 1.2.4.结果判断 以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC（用酶标仪测得OD600）。当阳性对照孔（即不含抗菌肽）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。通常对革兰阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的MIC与常量肉汤稀释法测得的结果相同或低一个稀释度（1孔或2倍）。 2.琼脂稀释法 2.1琼脂

7、稀释法：琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌肽药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH或LB琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。 2.1.1培养基和抗菌肽原液制备 使用LB琼脂，pH7.2~7.4。按照倍比稀释法，分别配制12800、6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5ug/mL的抗菌肽原液（如采用90%的抗菌肽，可以从320

8、0ug/mL进行稀释）。2.1.2含抗菌肽琼脂平板制备 将配制好的