细胞生物学创新实验

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1、植物组织培养——外植体的接种，灭菌与初代培养一、实验目的通过实验初步掌握外植体材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体初代培养的方法。二、实验原理植物组织培养是在无菌条件下对离体的植物器官或组织的培养。而植株各部分的表而携带着各种不同的微生物，所以在接种前就必须选择合适的消毒剂对外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前捉和重要保证。离体器官或组织受到适当刺激，便可进行器官分化，从而实现细胞的全能性。三、实验材料、试剂和仪器设备1.实验材料：喜树当年生枝条2.试剂：升汞，吐温-803.仪器设备（以各组所需为例）无菌器材：4瓶培

2、养基，一个无菌烧杯+吸水纸，1升无菌水，大号、中号银子各1把，1把解剖刀、1把剪刀,2个500ml烧杯非无菌材料:0.1%升汞消毒液200ml,1个250ml消毒缸，1盏酒精灯及火机1个,1个烧杯,内装75%酒精150ml,1个烧杯,内装75%酒精及棉球，1把大号银子、1把枝剪、1把解剖刀、1把旧牙刷，橡皮筋若干、标签纸、记号笔、洗衣粉、毛巾、喷雾器四、实验步骤1・配制培养基。培养基组成：MS+BAO.5mg/L+NAA0.lmg/L+蔗糖+琼脂①将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器血等放在指定位置。本实验需配制的培养基所需吸取的各种母液

3、的用量如表1所示：母液名称母液浓度400ml培养基吸取屋MSI20mlMSII2mlMSIII2mlMS1V2mlNAA0.1mg/ml0.4mlBA0.5mg/ml1ml①取500ml烧杯一个，用量筒量取大量元素母液，然后用各母液专用移液管分别吸取微量元素母液，有机母液、铁盐母液和生长物质付液，置于烧杯中。②称虽琼脂2.6g和12g蔗糖分别倒入烧杯中，再加蒸钿水定容至400ml。③充分混合后，用Imol/LNaOH和lmol/LHCl调节培养基的pH为5.8。④将烧杯置于电炉上或微波炉内加热，待琼脂少蔗糖充分溶解后，取出烧杯，再稍稍搅拌,冷却。⑤

4、把稍冷却的培养基分装到培养瓶中，每瓶约15mlo用封口膜封好瓶口。贴上标签，注明培养基名称，配制者姓名和配制日期，再进行灭菌。2.培养基灭菌（灭菌条件:12KC,15分钟）①检査灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。②盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。③火菌时间到后，先切断电源，让火菌锅内温度白然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时,打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。④刚火过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。放置在

5、水平桌血上自然冷却。3.接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养某及接种用具放入超净工作台。房间用酒精喷雾降尘示打开超净工作台紫外灯及房间的紫外灯，照射约30mins；然示关闭紫外灯，打开房间换气扇以及超净工作台的风机，并微启超净工作台的玻璃挡板，通风20min后,即可进行无菌操作。4.选取生长健壮的枝条，用饱满又术萌发的侧芽作为外植体（取中部的芽鮫好）。将外植体川手术刀切去叶片，并剥去附在茎上的叶柄及皮刺，川毛刷沾洗衣粉刷洗并在自來水下冲洗T净。吸干水份后切成约2-3cm的茎段，每段至少有1个侧芽。将处理好的外植体转入洁净的消毒缸中，用

6、加了数滴吐温-80的0.1%的升汞溶液浸泡lOmino在表面灭菌过程，应不停摇动消毒缸使消毒液与外植体充分接触。2.进入接种间，用酒精棉球仔细擦拭双手至手腕部位3.把浸泡在消毒液中的外植体转移到超净工作台屮。消毒时间结束后在酒精灯火焰旁用无菌锻子将己完成表面灭菌的外植体转移到烧杯屮，川无菌水清洗5次，每次不少于1分钟，洗时不断摇动烧杯以确保完全除去消毒剂。最后一次清洗后将外植体转移到无菌烧杯上，吸T水分备用。4.接种时，将消毒后的外卅i体首尾切除（中间至少有一芽），再按极性方向用蹑子接种到培养基上，接种时，每一次操作完后将银了等器械浸入75%酒精中

7、，再将器械取出后置于酒精灯火焰上充分灼烧，待冷却后方可使用。每瓶可接入3〜4段喜树茎段。&每瓶接种完毕后，将瓶口置火焰上转动烧烤，以杀死瓶口上的细菌，再封好瓶口，贴上标签。9.接种完后清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30分钟。10.将培养瓶放置在21±2°C,光强800〜12001X,光周期为12h的环境下培养。每周观察一次，将污染的外植体拿走洗掉。