蛋白质与酶工程实训报告

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1、2014-2015学年第二实践学期蛋白质与酶工程综合实训报告专业：生物技术班级：B1204姓名：李佳俊学号0514120406指导】教师:韦月平二O—五年七月六日姓名李佳俊性别男专业生物技术班级B1204日程和实训地点实训内容简介：蛋白质工程和酶工程是继基因工程之后发展起来的生物学技术，它们是基因工程的一个重要组成部分，或者说是新一代的基因工程。蛋白质工程是指按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等，为获得

2、的新蛋片具备冇意义的新性质或新功能，常对已知的其他蛋白质进行模式分析或采取分子进化等手段。酶工程属于蛋白质工程的i部分，酶制剂在工业上的大规模应用，主耍由酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和生物反应器四个部分组成。木次实训有机溶剂沉淀法制备大豆腺酶、豚酶活力的测定（纳氏试剂比色法）、腺酶Km值简易测定、双酶法制备淀粉糖以及不同浓度果胶酶对澄清果汁收得率的影响等，我们希望通过此次实训可以增强自己的动手的能力，使理论和实践相结合，并且可以巩固在课堂上学习的理论知识。木次实训主要分为三个部分：1.实训一有机溶剂沉淀法制备大豆腺酶以及腺酶的K

3、m值和活力测定2•实训二双酶法制备淀粉糖3.实训三不同浓度果胶酶对澄清果汁收得率的影响实训报告实训一有机溶剂沉淀法制备大豆服酶以及腺酶的Km值和活力测定所需药品与仪器：药品：2%冰酷酸、64%和32%的丙酮、3%尿素底物溶液、磷酸盐缓冲液、Imol/1H2SO4溶液、硫酸讓标准溶液、纳氏试剂、豚酶液、30%酒精、ol/L腋液、100g/l硫酸锌、100g/l酒石酸钾钠、0.5mol/lNaOH、显色液、新鲜人豆粉。仪器：恒温水浴锅、72型分光光度计、小漏斗、滤纸、移液器等。(-)制备大豆腺酶一、实验原理：淼酶广泛存在于微生物和动、植物

4、组织中，1926年,SumnerJ曾用32%的丙酮溶液从刀豆粉中提取淼酶，并得到了结晶。该酶相对分子质量为483000,曲6个亚基组成，等电点4.9,溶于水和稀缓冲液,粗酶较稳定、纯酶不太稳定，结品酶在低温下可稳定1年以上。本实验用乙醇或丙酮从大豆中提取淼酶，并用冇机溶剂和等电点结合法制备该酶。实验步骤1.称取10g黄豆粉和黑豆粉分别加入50ml32%丙酮溶液屮。2.在冰浴中持续摇动4-5min,4层纱布过滤，收集滤液。3•将滤渣重新置于锥形瓶屮，另加10ml32%丙酮，再捉取一次，4层纱布过滤，滤液在4°C,3500r/min条件下

5、离心8min-10min,,计量体积，取lml酶液保存，供测酶活力和蛋口质用。4•将捉取的酶液置冰浴屮，在缓慢搅拌下，用滴管逐滴滴加2%醋酸，并不断用精密PH试纸检测PH变化，观察产生浑浊的现彖，直至PH4.9左右。5.置4°C低温卜•过夜，可吸出沉淀。6•将沉淀物仔细转入预冷的离心管，在4°C,3500r/min离心lOmin,上清液回收丙酮，沉淀即为U尿酶粗品，风干后，称重，计算酶的收得率。7•将所得粗酶溶于少许蒸馆水中，吸取适宜量用于测定酶活力和蛋口质，此即粗酶活力，酶溶液在冰浴屮冷至2°C-4°C,搅拌下缓慢滴入等体积64%的

6、预冷丙酮溶液，保持低温条件下让其缓慢析出结晶。三、实验结果：黄豆：0.2462g黑豆:0.0126g黄豆酶的收得率为：0.2462g/10g=0.02426二2.426%黑豆酶的收得率为:0.0126/10g=0.00126=0.126%结果分析：酶的收得率比较低可能原因：1•大豆粉在过滤是过滤不充分，有一部分在滤网上。2•对沉淀的风干不彻底。1.实验过程中操作造成酶液损失等。（-）服酶活力测定（纳氏试剂比色法）一、实验原理：腺酶催化尿索水解成氨和二氧化碳，最适反应pH7.0o氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成止比，故

7、可以测定JR酶活力的大小。二、实验步骤：按以下步骤操作：取3支洁净干燥试管，编号：1•空白；2•标准；3•样品。按卞表步骤加入实验制备的酶液及试剂：试骤1231）适当稀释的黄豆待测酶液（ml）001.002）标准硫酸鞍溶液（ml）00.3003）蒸憾水（ml）2.001.701.004)lmol/L硫酸(ml)1.001.0005）25°C恒温水浴屮平衡5mino6)3%尿索(ml)1.001.001.007）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min,立即向样品管（3号管）加1mol/L硫酸1.00ml,终止反应。8）另取三只洁净试管

8、，分别对应于上面各反应液进行显色。反应液（ml）0.200.200.20蒸谓水（ml）4.304.304.30纳氏试剂（ml）0.500.500.509）各管混匀后,30min内,用分光光度计测试:比色记录A480nmA