cck-8抗炎作用的受体及信号转导机制的研究

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1、河北医科大学博士学位论文CCK-8抗炎作用的受体及信号转导机制的研究姓名：许顺江申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：丛斌20040401中文摘要CCK-8抗炎作用的受体及信号转导机制的研究摘要感染性及创伤性疾病并发多器官功能障碍综合征〔MODS)的主要发病机制是内毒素诱导产生过量炎症介质引起的炎症失控。单核一巨噬细胞的活化在诱导炎症反应中起关键作用。内毒素的主要活性成分LPS或其它致炎因素激活巨噬细胞释放大量炎症介质，包括TNF-a,IL-1p和IL-6等，引起机体自身组织损伤，导致过度的全

2、身性炎症反应综合征(SIRS)，最终导致MODS以至死亡。肺脏是公认的较早发生功能障碍的器官，LPS激活肺巨噬细胞产生炎症介质引起急性肺损伤(ALI)甚至急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。肺巨噬细胞包括肺泡巨噬细胞(AMs)、肺间质巨噬细胞(PIMs)和肺血管内巨噬细胞。近年来的研究表明，在内毒素血症时，PIM:更早受到LPS的攻击，其吞噬功能、对补体的趋化作用及产生氧自由基的能力明显强于AMs，在肺组织炎症反应中起重要作用。胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)最早发现于肠道并作为胃肠激素调节

3、胆囊的收缩和胰腺的生长分泌功能，后来的研究发现CCK广泛存在于中枢和周围神经系统，作为神经递质或调质发挥重要作用。CCK在体内存在多种活性形式，包括4,8,33,39和58月太等，其中八肤胆囊收缩素(CCK-8)是存在于小肠、血液和中枢神经系统最重要的活性形式。多年来本室对CCK-8的抗炎及抗休克作用进行了系列研究。在内毒素休克时，CCK-8可抑制TNF-a,IL-la和IL-6等促炎细胞因子的产生;体外实验也表明CCK-8可剂量依赖性地抑制LPS诱导PIMsTNF-a的产生、sCD14的释放及mCD14的

4、表达。形态学观察也证实了CCK-8可减轻内毒素休克大鼠的肺、脾和肝的组织损伤程度，表明CCK-8具有明显的抗炎及抗休克作用，但其抗炎作用的受体及信号转导机制尚不清楚。CCK要发挥其生物学作用，首先要和存在于其靶细胞表面的CCK受体结合，CCK受体属于G蛋白偶联受体，在体内分布十分广泛。根据其对内源性配基亲和力的不同可分为CCK-AR和CCK-BR两种亚型。我们新近的研究发现，在大鼠肺组织、心肌组织和脾细胞均有CCK-AR和CCK-BRmRNA的表达，而且LPS可诱导其表达上调。提示CCK-8可能通过与其受体

5、相互作用，l中文摘要干预LPS对免疫细胞的活化过程，从而发挥抗炎及抗休克作用。在LPS诱导巨噬细胞活化过程中涉及多条信号通路，并且它们之间还存在着交互作用(cross-talk).LPS诱导细胞因子的产生和释放需要激活多个转录因子，包括NF-KB,STAT1和AP-1等。其中最重要的是NF-KB,可调节多种细胞因子在炎症反应中的表达。NF-KB属于NF-KB/Rel家族，静息状态下与抑制蛋白I-KB结合以无活性形式存在于细胞浆中，I-KB发生磷酸化并降解使NF-KB活化转位入核启动目的基因表达。DAG-PK

6、C是参与NF-KB上游活化机制的关键信号通路，特别是PKC屯，可不依赖IKK直接使P65亚单位(RelA)磷酸化，在调节炎症反应过程中发挥着极其重要的作用。因此本实验以体外培养的大鼠PIMs为对象，从受体、DAG-PKC通路、转录因子以及cAMP-PKA通路与DAG-PKC通路之间的Cross-talk等多个层面，系统研究了CCK-8在PIMs发挥抗炎作用的受体及信号转导机制。ICCK受体mRNA在大鼠肺间质巨噬细胞内的表达及脂多糖对其表达的影响用酶消化法结合肺泡和肺循环灌洗技术分离大鼠PIMs，用LPS(

7、10mg/L)孵育细胞不同时I句，采用RT-PCR及Southernblot技术检测CCK-AR和CCK-BR的基因表达及LPS对其表达的影响。数据以均值士标准差(r1S)表示，采用SPSS统计软件处理数据，组间差异采用单因素方差分析(ANOVA)，有显著性差异者用最小显著差法(leastsignificantdifference,LSD)进行两两比较，P<0.05为有显著性差异。结果显示:(1)CCK-AR和CCK-BRmRNA在大鼠PIMs中均有表达。CCK-ARmRNART-PCR扩增片段为1.37k

8、b,CCK-BRmRNART-PCR扩增片段为480bpo以p-actin做内参对照，片段长度为420bpa(2)CCK-ARmRNA平均表达水平(与p-actin的AU比值)对照组为(31.2士3.56)，LPS组。.5h,2h,6h和l2h分别为:(36.714.38)%,(59.2士3.41)%,(52.7土2.84)%和(51.313.15)%，与对照组比较除0.5h外均有显著性增加印<0.01).CCK