基因沉默的研究及应用实例简介

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1、目录1基因沉默的概述2RNA干扰3基因沉默的应用实例4RNAi的生物学意义1.基因沉默•定义：基因沉默（genesilencing）是指生物体中特定基因由于种种原因不表达或者是表达减少的现象。基因沉默现象首先在转基因植物中发现，接着在线虫、真菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中陆续发现。基因沉默发生的水平由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性降解而使基因失活转录后基因沉默基因沉默的方法（一）转录水平基因沉默：•1.基因及其启动子甲基化•2.同源基因间的反式失活•3.后成修饰作用导致的基因沉默•4

2、.重复序列•5.位置效应（二）转录后水平基因沉默共抑制基因压制RNA干扰2.RNA干扰•RNA干扰（RNAi）：是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi的特征（1）RNAi是转录后水平的基因沉默机制；（2）RNAi具有很高的特异性；（3）RNAi是以催化放大的方式进行的，因而RNAi抑制基因表达具有高效性；（4）RNAi可以穿过细胞界限抑制基因表达而且可以遗传；（5）dsRNA需要大于等于21个碱基（6）ATP依赖性RNAi的分子机制•相关酶及复合体-----•Dicer：RNaseIII特异核酸酶•

3、一种与RNAi有关的RNaseIII家族的酶，是生物进化中非常保守的序列，可以将dsRNA切割形成21-23nt的siRNA。•RdRP：(RNA-dependentRNApolymerase)•以单链RNA为模板，按碱基配对原则合成其互补链，形成双链RNA。RNAi的原理RNAi的基本过程siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA，消耗能量；RISC（RNA-inducedsilencingcomplex）形成：与RNAi辅助蛋白——argonaute家族分子、RNA依赖性聚合酶结合形成RISC，消耗ATP能量；RISC活化：siRNA解螺旋

4、成单链，无活性的复合体转变成活性形式；阻止翻译或诱导mRNA降解：在siRNA引导下，RISC识别并切割互补的靶RNA。RNAi研究的一般技术路线siRNA的设计•siRNA（smallinterferingRNAs，siRNAs）即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链RNA分子。一般设计原则：（1）从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。（2）将潜在的序列和相应的基因组数据

5、库进行比较，排除那些和其他编码序列同源的序列。（3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计4-5个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。负对照（1）一个完整的siRNA实验应该有负对照。（2）作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。（3）通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。制备siRNAs的方法化学体外合成转录用RNaseIII消化长片断siRNA表siRNA表双链RNA制达载体达框架备siRNA体外转录•以DNAOligo为模板，通过体外转

6、录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制。•值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。•最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。•不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究转染细胞•将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：•1.磷酸钙共沉淀•2.电穿孔法•

7、3.DEAE-葡聚糖和polybrene•4.机械法•5.阳离子脂质体试剂为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点：•1.纯化siRNA•2.避免RNA酶污染•3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性•4.避免使用抗生素3.基因沉默的应用实例抗肿瘤策略抗病毒RNAi技术在功能基因组中的应用RNAi技术在法医学中的应用抗肿瘤策略RNA干扰CYP17基因抑制前列腺癌细胞生长CYP17基因•CYP17基因位于染色体10q24.编码细胞色素P-450cl7a酶,后者介导着17、20裂解酶和17a羟化酶的活性,他们是由胆固醇合成睾酮过程中的两个关键酶

8、,在人体性