温州市科技计划项目申报须知

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1、科技计划项目可行性研究报告(1)立项的背景和意义喉癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，发病率呈逐年增加，在全世界常见的头颈部肿瘤中，居于第2,约占全世界所有肿瘤的1%-5%,并且常见于成年男性冋。在世界范围内，外科手术治仍是喉癌患者的主流治疗方案，对于喉癌的治疗，一方面以牺牲喉功能为代价，另一方面又要控制复发⑷。如何彻底切除癌肿，特别是晚期肿瘤，同时保留功能，减少复发，提高生存率和生存质量，一直是临床医生探索的方向。近年来，随着综合治疗临床研究的深入，激光和手术的进步，诱导化疗、术前或术后放化疗以及生物治疗的开展，喉癌的治疗进入了一

2、个新的时期。而化疗能提高局部控制率，降低复发与转移，提髙肿瘤治疗的生存率与改善患者的生存质量⑸，因此越来越多的国内外学者不断去寻求更有效且安全的化疗治疗手段。(2)国内外研究现状和发展趋势细胞死亡是生命现象不可逆停止及生命的结束，正常的组织中经常发生细胞死亡，是维持组织机能和形态所必须的。常见的细胞死亡方式分为程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)⑹和非程序性细胞死亡(non-programmedcelldeath,NPCD)o在正常情况下，我们身体内细胞的死亡大都是程序性死亡，这可以让新生的细胞取代

3、衰老的细胞，让我们的身体保持健康。程序性细胞死亡包括凋亡(apoptosis)、自噬(autophagy)等⑺引，2012年，Dixon等在研究小分子crastin杀死含有致癌基因RAS突变的肿瘤细胞的作用机制时发现了一种新的细胞死亡方式，叫做铁死亡(ferroptosis),是铁依赖性的细胞死亡形式，该死亡方式受细胞内信号通路的严密调节［%铁死亡的研究仅处于开始阶段，目前发现这一过程与凋亡、坏死和自噬在形态学、生物化学和遗传学等方面均有差异，典型的特征为线粒体变小，但双层膜的密度增加，同时表现为细胞质以及脂质活性氧自由基增多

4、。在铁死亡机制的研究中，国外研究者⑼发现erastin通过抑制细胞膜胱氨酸谷氨酸转运体(SystemXc"),减少细胞内胱氨酸的摄取而降低谷胱甘肽(GSH)的合成，使细胞内GSH含量下降，进而引起细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)活性下降，导致脂质过氧化反应增加、细胞内致死性的脂质ROS(活性氧簇)募集，对细胞产生杀伤作用。ROS是需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇，包括氧自由基，如0「、•0H、烷氧自由基(R0・)、过氧自由基(R00・)和一氧化氮(N0・)等，与非自由基，如H2O2、次氯酸(HOC1)和单线态氧('0

5、2)等，其能够氧化其他成分并将其转变成自由基，往往引起连锁反应，导致形成许多新的自由基近年来，广泛的研究显示，体内产生的活性氧，在不同的细胞信号传导通路中发挥重要作用〔°13,o同样铁死亡也是由ROS聚集而引起的，但是具体的ROS种类尚不明确，这点让人十分好奇，因此我们想对此进行更深的研究。此外，国外研究者发现RSL3、Lanperisone＞柳氮磺胺毗噪（SAS）、谷氨酸、Sorafinib等都能诱导肿瘤细胞或脑细胞发生铁死亡〔⑷⑹。而在我们之前的研究中，用青蒿素衍生物一一双氢青蒿素（DHA）作用于人头颈部肿瘤细胞，同样也发

6、现了铁死亡的存在。但是我们发现DHA作用后的细胞同时发生了铁死亡和凋亡的现象［⑺，而且国外研究者在研究P53时也发现其不仅使细胞周期停滞，还可引起凋亡，同时也出现了铁死亡的现象I⑻。所以我们猜测在凋亡或者其他程序性细胞死亡方式的信号通路上的蛋白在铁死亡信号通路上也起重要作用。于是我们想通过进一步的研究来验证我们的这一猜测，寻找此类蛋白，以明确其在铁死亡之中的作用与意义，为铁死亡的调控提供理论依据。（3）研究开发内容和技术关键本项目研究内容主要有三个部分一、引起铁死亡的R0S种类的研究1.用erastin这一能引起铁死亡的经典药

7、物作用于HEP-2喉癌细胞株上，运用Westernblot（蛋白印迹技术）确定用药后不同时间点细胞产生铁死亡上游相关蛋白的变化，如GXP4、E-Ras等。并用R0S相关的检测试剂盒，如：活性氧检测试剂盒、过氧化氢检测试剂盒、超氧化物检测试剂盒、脂质氧化（MDA）检测试剂盒等，运用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪等检测各个时间点各种R0S水平的变化。2.用erastin作用于HEP-2喉癌细胞株上，然后分别使用R0S清除剂，如NAC、Catalase（过氧化氢酶）、SOD（超氧化物歧化酶）等，再运用Westernblot技

8、术检测铁死亡上游相关蛋白的变化，再次验证R0S在铁死亡信号通路上的作用，从而寻找在铁死亡的过程中产生主要作用的R0S种类。二、参与铁死亡信号通路的调控蛋白的研究1.用erastin作用于HEP-2喉癌细胞株上，运用Westernblot（蛋白印迹技术）测定各个时间点上铁死亡上