分子实验手册实验指导自编编实验指导第三版

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1、分子生杨学卖验指导刘丈孟春晓盛桂华编写（第三次修订版）山东理工丸学生命科学学院二0—二年二月分子生物学是二十一世纪的前沿学科，实验操作是分子生物学的一个重要组成部分。结合木院教学计划、现有仪器设备以及材料情况，我们为生物工程、生物技术、生物科学三个本科专业安排了以基因重组体的构建和H的基因诱导表达为主线的一系列实验内容，旨在使学生掌握分子生物学基本实验技术，同时培养他们严谨的实验思路和良好的实验习惯。本实验指导包含学生实验、实验注意事项、思考与讨论、常用仪器使用、常用试剂配制等内容，全而科学地反映整个分子生物学实验教学的要求，可为学生进行实验提供有针对性的指导。分了生物学课程组二

2、oo九年^一月目录前言2目录3实验室守则4分子生物学实验安排明细表5实验一分子生物学实验流程及主要仪器设备介绍7实验二培养基的配制与细菌的纯化培养11实验三质粒的提取14实验四目的基因的PCR扩增及扩增产物回收17实验五琼脂糖凝胶电泳检测DNA21实验六PCR扩增产物与T载体的连接24实验七大肠杆菌感受态细胞的制备29实验八重组质粒的构建及转化32实验九重组子的筛选鉴定37实验十外源基因在大肠杆菌中的诱导表达及检测42附录1常用试剂及其配制46附录2常用试剂说明书53EcoR153B/WH154T4DNALigase55TaKaRaTq™57DL2,000DNAMarker59

3、DL5,000DNAMarker60蛋白质分子量标准(低)ProteinMolecularWeightMarker(Low)61附录3常用仪器设备使用说明及使用注意事项62微量移液器62Heraeus离心机64PTC-200型PCR仪65DYY-8C电泳仪74UVP凝胶成像系统76KYQL-350X520FZ型小型压力蒸汽灭菌器77附录4常用实验材料保存方法80附录5实验报告格式及课程成绩评定办法81实验室守则1.穿着耍整洁规范，进入实验室必须穿实验服。2.实验室内禁止带入食品，勿高声谈话。3.实验前应当认真预习，熟悉实验内容，了解所用仪器用具；实验中应严格按操作规程进行，认真操

4、作、仔细观察，及时记录实验现象及结果；实验结束后，仔细分析和总结实验结果，认真做好实验报告。4.许多溶剂，像氯仿、异戊醇、异丁醇、正丁醇、甲醛和乙醞，应在通风橱中使用或使用时注意通风，并注意保护衣服、皮肤和呼吸道。有些试剂可能是致癌物或诱变剂，像澳乙锭、甲酰胺，丙烯酰胺等，在操作中应注意防护，并注意使用后的处理。注意防止紫外线对皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。1.各种试剂在使用前都应认真看使用说明，特别是一些试剂盒，在掌握有关知识后方可使用。2.实验室中所有仪器的使用都应在老师的指导下进行，或在阅读仪器的使用说明书后方可使用。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现

5、故障立即报告，不得擅自拆检。仪器使用后使用人要如实填写使用登记表。3.实验台应当保持整洁，仪器、药品摆放整齐，使用过的器具及玻璃器皿应洗净后放回原处。试剂应规范、节约使用。公用试剂用完后，应立即盖好放回原处。4.实验结束后整理好自己的实验区，值H生清理整个实验室环境卫生，并注意实验室的水、电、门、窗等方面情况。每天安排3・4人值日。分子生物学实验安排明细表注意：毎组约20人。根据悄况可适当调整实验步骤。配制需要加酶的反应体系时，建议一人加一种试剂，流水线操作，以防浪费严垂。时间项目学生操作内容分组时间建议第天下午了解实验流程、学习仪器使用、准备实验用品了解实验流程、学习微量移液器

6、使用14:30讲解实验注意事项及实验报告书写要求灭菌每组：1.5ml离心管、各种枪头各2盒等15:30含质粒菌种的培养每组接种2瓶16:00第天上午PCR扩增目的基因100ul扩增体系加样、扩增每人1管8:00流水线操作碱法抽提质粒抽提pBV220质粒，・40°C沉淀30min后离心、晾干每人1管9:00琼脂糖凝胶制备制备凝胶每组2块胶（约42个上样孔，每人2孔，分别上5ul质粒、PCR产物）10:00PCR产物沉淀回收加沉淀试剂、・20°C沉淀2h（或・40°C沉淀30min）每人1管11:00留出5ul电泳检测，其余沉淀回收下午PCR产物沉淀回收沉淀后的PCR产物离心、晾干、

7、加水溶解每人1管14:30质粒溶解晾干的质粒加20ul水溶解每人1管14:40培养基的配制、灭菌配制液体和固体培养基、灭菌、倒平板每组配液体LB500ml（30ml*16瓶）、固体LB800ml每组灭菌的器械：培养皿30个试管21支、10ml移液管1支、40inl离心管10个、牙签、CaCl2溶液15:00固体培养基倒平板时不加抗生素倒2个平板，其余加抗生素后倒平板电泳检测DNA电泳检测质粒及PCR产物15:30质粒和PCR产物的酶切50ul酶切体系，37°C水浴酶切过夜.（剩余