PCSK9基因D374Y突变体转基因猪的制备与分析

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1、PCSK9基因D374Y突变体转基因猪的制备与分析张雪黄雷阮进学刘志国程英冯书堂牟玉莲奎中国农业科学院北京畜牧兽医研究所摘要：［目的】前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proproteinconvertasesubt订isin/Kexintype9,PCSK9)基因是人类高胆固醇血症(autosomaldominanthypercholesterolemia,ADH)的主效基因之一，其获得型突变与人类家族性高胆固醇血症有直接的关系。PCSK9-D374Y突变体对低密度脂蛋白受体(lowdensitylipoproteinreceptor,LDLR)的降解能力比野生型蛋白强十倍，增加

2、了患高胆I占I醇血症的风险，从而加速动脉粥样硬化的进程。猪心血管系统和血脂代谢方面与人类非常相近，成为研究动脉粥样硬化疾病的理想模型之一。然而自然发病的猪缺乏，且诱导病征发生缓慢。因此拟利用体细胞克隆技术制备PCSK9获得型突变体转基因猪，以模拟动脉血管的病理学变化，加速发病进程，为动脉粥样硬化的研究提供理想的动物模型。【方法】研究使用人PCSK9慕因D374Y突变体载体，用电转染的方法将其整合到五指山小型猪近交系胎儿成纤维细胞中，并通过体细胞核移植技术获得了人PCSK9基因D374Y突变体转基因猪个体。通过Southern-blol、实吋荧光定量PCR、Western-b

3、lot等方法，分别从DM、RNA＞蛋白的水平检测了人PCSK9基因在转基因猪肝脏中的整合表达情况。同时，通过组织化学染色与H.E.染色的方法对转基因猪进行了组织学检测。【结果】转基因阳性细胞集落在药筛的第3天开始出现，至第7天形成较大的单克隆点，且PCR检测结果显示扩增产物可以拼接为完整片段，说明外源片段在基因组中具有完整性;将筛选得到的阳性细胞作为体细胞克隆的供体细胞，通过体细胞核移植技术获得了转基因猪个体。PCR及Southern-blot检测结果显示，D374Y-PCSK9基因可以完整的插入猪的基因组中，且有吊联重复现象;RT-PCR和QPCR检测结果表明，人PCSK

4、9基因能在猪肝脏内正常转录且不影响猪内源性PCSK9基因的转录，且在其它内脏器官，如心、脾、肺、肾也能检测人PCSK9基因的表达，而猪内源性PCSK9基因在这些组织中表达量很低;Western-blot检测结果与RNA水平的检测类似。这些结果说明人D374Y-PCSK9基因成功整合到猪基因猪中，且能够正常转录与翻译。通过组织化学染色发现，与野生型猪肝脏相比,克隆猪肝脏中LDLR蛋白水平极显著低于野生型。另外，对克隆猪进行H.E.染色后发现其肝脏组织有明显的病理学变化，该结果说明，LDLR水平的急剧下降有可能是导致肝脏病变的原因。【结论】成功获得了人PCSK9基因D374Y突

5、变体的克隆猪;与野生型猪肝脏相比，克隆猪肝脏屮LDLR水平显著降低，并且克隆猪肝脏发生了明显病变。关键词:D374Y突变体;体细胞核移植;五指山小型猪近交系;LDLR;作者简介:作者简介:张雪,Tel:13161163940;E-mail:zhangxuecaas@163.com。牟玉莲；E~mai1:muyulian76@iascaas.net.cn收稿日期：2017-03-10基金：国家自然科学基金(31572378)ProductionofTransgenicPigsOver-ExpressedPCSK9D374YMutantZHANGXueHUANGLeiRUANJ

6、inXueLIUZhiGuoCHENGYingFENGShuTangMUYuLianLIKuiInstituteofAnimalSciencesofChineseAcademyofAgriculturalSciences;Abstract：[Objective]Proprotcinconvcrtascsubtilisin/kcxintype9(PCSK9)isthethirdmajorgeneofautosomaldominanthypercholesterolcmia(ADH)•Gain-of-functionmutationsofPCSK9aredirectlyasso

7、ciatedwithhumanfamilialhypercholesterolemia,suchastheD374Ymutant.InvitrodetectionexperimentalresultsonthedegradationofLDLRbythePCSK9D374YmutantshowedthatitsLDLRdegradationabilityistentimesstrongerthanthatofthewild-typeprotein.Thisabilityincreasestheriskofhyper