生物制药之胰岛素

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1、生物制药之胰岛素主要内容1、胰岛素简介2、胰岛素的功能作用3、利用大肠杆菌生产重组人胰岛素4、新型固液分离技术在重组人胰岛素生产中的应用1.1、胰岛素（insulin）定义：由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。1.2、胰岛素的发现1921年----从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。1926年----重结晶胰岛素1930s----传统中、长效动物胰岛素1970s----单峰胰岛素和单组分胰岛素70年代末----半合成胰岛素19

2、82年----采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。90年代至今----重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效和长效人胰岛素类似物。1.3、胰岛素结构组成胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键人胰岛素的一级结构猪胰岛素的一级结构1.4、胰岛素的空间构型胰岛素二聚体（dimer）胰岛素六聚体（hexamer）2

3、、胰岛素的功能作用主要功能：2.1、调节糖代谢；2.2、调节脂肪代谢；2.3、调节蛋白质代谢；2.4、其它功能2.5、体内对抗胰岛素的激素2.1、调节糖代谢胰岛素能促进全身组织细胞对葡萄糖的摄取和利用，并抑制糖原的分解和糖原异生，因此，胰岛素有降低血糖的作用。胰岛素降血糖是多方面作用的结果（1）促进肌肉、脂肪组织等处的靶细胞细胞膜载体将血液中的葡萄糖转运入细胞。（2）通过共价修饰增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高cGMP浓度，从而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降低，加速糖原合成、抑制糖原分解。（3）通过激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶而使丙酮酸脱氢酶激活，加速丙酮酸氧化为乙

4、酰辅酶A，加快糖的有氧氧化。（4）通过抑制PEP羧激酶的合成以及减少糖异生的原料，抑制糖异生。（5）抑制脂肪组织内的激素敏感性脂肪酶，减缓脂肪动员，使组织利用葡萄糖增加。2.2、调节脂肪代谢胰岛素能促进脂肪的合成与贮存，使血中游离脂肪酸减少，同时抑制脂肪的分解氧化。胰岛素缺乏可造成脂肪代谢紊乱，脂肪贮存减少，分解加强，血脂升高，久之可引起动脉硬化，进而导致心脑血管的严重疾患；与此同时，由于脂肪分解加强，生成大量酮体，出现酮症酸中毒。2.3、调节蛋白质代谢胰岛素一方面促进细胞对氨基酸的摄取和蛋白质的合成，一方面抑制蛋白质的分解，因而有利于生长。腺垂体生长激素的促蛋白质合成作用，

5、必须有胰岛素的存在才能表现出来。因此，对于生长来说，胰岛素也是不可缺少的激素之一。2.4、其它功能胰岛素可促进钾离子和镁离子穿过细胞膜进入细胞内；可促进脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成。2.5、体内对抗胰岛素的激素体内对抗胰岛素的激素主要有胰升糖素、肾上腺素及去甲肾上腺素、肾上腺皮质激素、生长激素等。它们都能使血糖升高。胰岛素与胰高血糖素的拮抗作用3、利用大肠杆菌生产重组人胰岛素提取步骤：3.1、提取目的基因3.2、提取质粒3.3、基因重组3.4、将质粒送回大肠杆菌3.5、胰岛素的产生3.1、提取目的基因既从人的DNA中提取胰岛素基因,可

6、使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。1.鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，可用DNA分子杂交，即DNA探针。2.人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。3.从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用。4.PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作。3.2、提取质粒从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状。此质粒将作为胰岛素基因的载体。提取方法：1.碱裂解法：在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。闭合环状的质粒DNA，在变性后不

7、会分离，复性快。2.煮沸法：将细菌悬浮于含TritonX-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。3.小量一步提取法：由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒DNA会变性，机械力后复性。但质粒DNA的复性要快于细菌染色体DNA。3.3、基因重组取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”,形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。3.