木寡糖的研究

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1、木寡糖的研究摘要：研究从啤酒酵母屮提取和提纯蔗糖酶的方法技术。采用菌体的自溶的方法來破碎细胞壁后菌体分离提取蔗糖酶液，再经过热提取、乙醇沉淀和QScpharosc柱层析法纯化蔗糖酶。通过蔗糖酶水解蔗糖测定各种捉纯液的酶活；用Folin-酚试剂法和微量凯氏定氮法测蛋口含量并比较两种方法优缺点；再用SDS-PAGE测定蛋白质的相分子量。通过对实验数据的分析得出用乙醇提纯液总活力最高，所含蔗糖酶比例最大蔗糖酶(Sucrase,EC3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)o可作用于B-1,2糖甘键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高，约为蔗糖的1・36〜1.60倍在工业

2、上具有较高的经济价值。(1)以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。(2)目前关于酵母屮蔗糖酶提取纯化方面的研究较多(3)从屮可以看到，每摩尔蔗糖水解产牛两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过Nelson法测定还原糖的产生数量來测定。一个酶活力单位规定为为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有的酶活力单位。啤酒醉母中含有丰富的蔗糖酶，本实验以它为原料，通过破碎细胞、热处理、乙醇沉淀柱层析等步骤提取蔗糖酶.并对其性质进行测定。除非特别说明，所有的纯化步骤均在o—4°CZ

3、间进行。细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。我们用的菌体(微生物)细胞破壁方法是：自溶法,即将菌体放在适当的PII值和温度卜•，利用组织细胞口身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂,以防外界细菌污染。自溶法的缺点是时间较t该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁屮的称之为外蔗糖酶(externalyeastinvertase)，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细

4、胞质中的称之为内蔗糖酶(internalyeastinvertase),含有少量的糖。两种酶的蛋口质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met,它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的來源冇关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而口由于内酶含量很少，极难提取o酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数Km值等于酶促反应速度为最大速度的一半时所对应的底物浓度，其数值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同

5、酶的Km值不同，同一种酶在与不同的底物反应时，英Km值也不同。Km值反映了酶和底物亲和能力的强弱程度，Km越大表明酶与底物的亲和力越弱；Km值越小，表明酶与底物的亲和力越强。酶的活力就是酶所催化的反应的能力，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程屮的反应速度。从进程曲线來看，在一定时间内反应速度维持恒定.但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。为了准确表示酶的反应速度通常采用初速度表示。酶活力可以被某些物质改变(激活或抑制)。凡能降低酶的活性甚金能使酶失活的物质，均称为抑制剂，其屮又

6、冇可逆抑制和不可逆抑制类型。而可逆的抑制乂包括有竞争性抑制、非竞争性抑制等类型。在有抑制剂存在的条件下，酶的一些动力学性质会发生改变，如Km,Vmax等。而酶的Km>Vmax口J通过作图法求得,其方法很多，最常用的就是双倒数作图法)。2、3,5-二硝基水杨酸比色定糖的原理(1)DNS试剂+D-葡萄糖氨基化合物(还原糖)(棕红色)(2)在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系(可用于比色测定)，所以可用DNS比色法测定述原糖的含量。1.3酶活性测定详见文献(4)稀是酶液015mL,加013mLpH416.Oilmol/L的NaAc2HAc缓液，012mLOilmol/L的蔗

7、糖,37°C准确反应min，后加01125mL1mol/L的NaOII中止反应(5)S法在540nm波t下测定形成的还原量。在测定条件下以每分钟内能水解蔗糖成述糖，经DNS测定光吸收读数为1mA所需的酶量(6)1个酶活力单位(U)o1.4口质含量的测定(5)wry氏法测定蛋白质的浓度，以牛血清白蛋白为标准，绘制标准曲线。1.5S2PAGE具体步骤参照文献(6)质量分数为12%，浓缩胶质量分数为5%。1.6聚焦用PhastSystem全自动快速水