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《酶促合成2’，3＇-双脱氧双脱氢-5-氟胞嘧啶核苷的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、文章第号：1001-3555(2007)024)168-04酶促合成3—双脱氧双脱氢-氟胞嗦唳核昔的研究成娜，傅绍军，朱利民°(东华大学生物科学与技术研究所，上海200051)播要：从瑞士乳酸杆菌LactobacUlus辰加诚:©(ATCC8018)中提取了N・脱氧核昔转移酶进行催化合成抗病禅药物2',3,・双脱氧双脱氢・5■氟胞喘喘核昔(D-D4FC)的反应.考察了反应时间、反应液的pH值、缓冲液以及反应底物浓度对反应产率的影响.关键词小•脱氧核昔转移酶；2，,3，•不饱和$氟胞喘噪核昔；D・D4FC中图分类号：0643.32文献标识码：Ap-D-23
2、-双脱氧双脱氢・5■氟胞喘唳核昔(D・D4FC)3是第二代对人体线粒体没有毒副作用的核昔类似物⑴.据报道，它能抑制对AZT,DDC,DDI,D4T和3TC有抗药性的HIV-1型病毒，同时,对HBV也有很强的抑制作用⑴.该药已经在美国、德国和法国开始二期临床试验.到目前为止，D-D4FC仅有化学合成法的报道［3®.化学合成路线的收率比较低，摩尔总收率都在10%左右；化学合成的条件比较苛刻，需在低温下操作，工业化难度比较大；在化学合成的过程中需要用不可回收的重金属催化剂，不仅对工人的身体有毒害，而且对环境也很不友好，不符合现在倡导的绿色友好化学主题.利用生物酶
3、催化合成的方法将是今后发展的趋势.因此，我们希望能找到一条用生物酶催化合成3的途径.在我们的实验中，我们应用从瑞士乳酸杆菌Lactobacillushelveticus{ATCC8018)中提取的N■脱氧核昔转移酶⑼，进行催化碱基交换反应，其反应如图示1所示.1实验部分1・1试剂与仪器Scheme1(Thymine)4(布鲁克).12脱氧核糖转移酶的制备与酶活测定L2.1脱氧核糖转移酶的制备鉴于许多科研工收稿日期：2006-02-22；修回日期：2006X)5-30・基金项目：上海市科委浦江人才计划资助项目(05PJ14014).作者简介：戒娜，女，198
4、2年生，硕士研究生.1)通讯联系人.E-mail：lzhu@dhu.edu.cn.试剂：p-D-23Z-双脱氧双脱氢胸腺嗨睫核昔(D-D4T)1,99%,浙江康裕药业有限公司；5•氟胞喘陀(5・FC)2,99%,南通海斯特药业有限公司.仪器：Waters5110型高效液相色谱彳义，LGJ-10型冷冻干燥仪(北京松源华兴科技发展有限公司)，LC-MS(岛津QP-2010),AV400核磁共振波谱仪作中瑞士乳酸杆菌Lactobacillushelveticus(ATCC8018)优秀的催化性能，我们选取此菌种作为我们的产酶菌.菌种ATCC8018以Cardi
5、naudR.论文中报道的培养基⑼，于250mL锥形瓶中，40%,120rpm空气摇床培养40h.发酵液在4力下离心(20000g,15min),以pH=5.9的0.05mol/L柠檬酸缓冲液洗涤菌体后，离心收集.收集的湿菌体用液氮速冻，融化，研磨，再重复进行速冻融化，并研磨至呈糊状后，以1：3(lg湿菌种：3mLpH=6.0的0.1mol/L磷酸缓冲液)的比例将糊状物悬浮于磷酸缓冲液中，4兀下离心(16000g,30min),取上层清液即为粗制的脱氧核糖转移酶.1.2.2脱氧核糖转移酶的酶活测定在3mL石英比色皿中加入1mL0.3mol/LpH=6.0的磷
6、酸缓冲液，0.4mL水，0.5mL1mmol脱氧肌昔，0.1mL1mg/mL的黄嗦吟氧化酶.2min后，加入0.5mL1mmol腺瞟吟及0.5mL脱氧核糖转移酶，在290nm波长下测定吸光度变化.酶活定义：一个酶活单位是在上述条件下，每分钟生成ljunol次黄嗥吟矗需的酶星，即每分钟变化4.07个吸光度单位所需的酶U⑼.按以上条件，Lactobacillushelvelicus(ATCC8018)发酵40h后收集菌体并破碎得到粗制的脱氧核糖转移酶，测定其酶活可达到0・9U/mL.1.3D-D4FC的酶法催化合成取112mg(50mmol)底物1,124mg
7、(100mmol)底物2,10mL(pH6.4)缓冲液，4mL自制的脱氧核糖转移酶液于50mL的锥形瓶中，在40兀恒温水浴中以150rpm振荡反应24h.之后，在沸水中煮沸5min以终止反应.反应液被冷冻干燥,残留物用20mL甲醇萃取，减压浓缩得固体混合物.固体混合物经过硅胶层析柱(10%CH3OH/CH2Cl2,v/v)纯化，得27.5mg(24.12%)目标产物3・1.4分析方法与分析结果1.4.1薄层层析色谱法分析(TLC)反应过程中定性分析采用TLC法.•以活化硅胶G板为载体，二氯甲烷•甲醇■水(8：2：0.25v/v)为展开剂，紫外显色.1、3、
8、2及胸腺唏陀4的Rf参考值分别为0・82、0・61、0.29及0.
