EMSA实验方案(RNA & Proteins)

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1、·EMSA实验操作（RNA&Proteins）1.实验设计首次实验为确保系统的正确工作和操作的正确性，设计将ControlSystem和TestSystem一起电泳。聚丙烯酰胺凝胶泳道共10个，“#number”表示泳道序号。Table1.Controlreactionsfortheexpectedresults.ComponentFinalAmountControlReactions#1#2#3UltrapureWater----12μl11μl9μl10×BindingBuffer1×2μl2μl2μl50%Glycerol2.5%1μl1μl1μl100mMMgC

2、l25mM1μl1μl1μl1μg/μlPoly(dI·dC)50ng/μl1μl1μl1μl1%NP-400.05%1μl1μl1μlUnlabeledEBNADNA4pmol--------2μlEBNAExtract1Unit----1μl1μlBiotin-EBNAControlDNA20fmol2μl2μl2μlTotalVolume----20μl20μl20μlTable2.BindingreactionsfortheTestSystem.ComponentFinalReactionsAmount#4#5#6#7#8#9#10----5L1D5L6DW0P

3、PP0P3UltrapureWater----10×BindingBuffer1×2μl2μl2μl2μl2μl2μl2μl1μg/μlPoly(dI·dC)50ng/μl1μl1μl1μl1μl1μl1μl1μlOptional:50%Glycerol2.5%1μl1μl1μl1μl1μl1μl1μlOptional:1%NP-400.05%1μl1μl1μl1μl1μl1μl1μlOptional:1MKClOptional:100mMMgCl25mM1μl1μl1μl1μl1μl1μl1μlOptional:200mMEDTAUnlabeledTargetRNA4

4、pmol----------------------------ProteinExtract2μg----BiotinEnd-LabeledTarget20fmolRNATotalVolume----20μl20μl20μl20μl20μl20μl20μl根据第一次实验结果，不同时期探针结合情况不同，以另外两批材料的核蛋白重复实验各一次；若实验结果显示某个时期结合较为明显，可选择结合最显著的时期的核蛋白进行下一步竞争实验验证，设计不同浓度梯度的UnlabeledTargetDNA(coldprobe)特异性竞争结合，排除非特异性结合的可能；最后在与探针结合的蛋白的位置凝

5、胶切下测序。1·2.实验准备2.1试剂注意：（以下0.1%DEPC溶液未灭活，不可重复使用）试剂瓶一律使用强酸过夜浸泡，并用自来水冲洗20次，超纯水冲洗20次，并用0.1%DEPC溶液（未灭活）过夜浸泡，高压蒸汽灭菌30min，使用过程避免交叉污染及引入RNase；电泳装置中，电泳槽及其他接触电泳液的一切设备使用0.1%DEPC溶液过夜浸泡，枪头、EP管避免引入RNase，同时注意整个操作过程必须戴手套、口罩，任何可能引入RNase的接触都必须换掉手套；配制试剂的溶液及容器必须经过DEPC处理，容器处理同上，溶液处理时注意含Tris的试剂不能直接加DEPC，DEP

6、C也能与胺及巯基反应，应使用DEPC水（已灭活）配制；尼龙膜、滤纸、海绵使用0.1%DEPC溶液浸泡于广口瓶过夜，高压蒸汽灭菌30min，于溶液中保存过程中注意密封；DEPC是RNA酶的化学修饰剂，在本实验中非常重要，未灭活DEPC具刺激性和吸入毒性，请于抽风橱操作；它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性；DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。500ml5×TBE（DEPC水配制；0.22μm水系滤头过滤）：Trizma(Tris)……………………27gBoric

7、acid………………………13.75g+0.5mol/LEDTA-Na(pH8.0)…10ml或直接加Na2EDTA·2H2O…………1.86g超纯水400ml溶解，定容到500ml，室温保存，使用前用0.22μm水系滤器过滤；25ml40%Acrylamide（DEPC水配制；丙烯酰胺/甲双叉丙烯酰胺：19﹕1）：Acrylamide………………………9.5gBIS………………………………0.5g超纯水10ml溶解，定容至20ml，0.22μm水系滤器过滤，于棕色瓶中4℃保存；1ml10%AP（DEPC水配制；过硫酸铵；不可使用过旧的）