高效液相色谱详解-郝建涛

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1、高效液相色谱（HPLC）主讲：郝凤霞能源化工重点实验室目录基础理论上机操作前的准备工作Agillent1100的操作常见故障排除HPLC在科研中的应用一、基础理论溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。1、色谱柱的分离原理色谱分析法的分类按两相的状态分类流动相液体流动相气体固定相固体液体固定相固体液体名称液固色谱液液色谱名称气固色谱气液色谱总称液相色谱总称气相色谱

2、2、分离模式——键合相色谱、液液色谱、尺寸排阻色谱键合相色谱正相色谱：流动相极性<固定相极性分离在水中绝对不溶解的物质或同分异构体反相色谱：流动相极性>固定相极性常规分析，80％色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线。基线(baseline)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)

3、--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。3、HPLC中的基本概念和术语色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。峰高(peakheight，h)-峰的最高点至峰底的距离。峰宽（peakwidth，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。半峰宽（peakwidthathalf-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。峰面积(peakarea

4、，A)-峰与峰底所包围的面积。死时间(deadtime，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。保留时间(retentiontime，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。流动相的洗脱方式等度洗脱输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂梯度洗脱A泵进样器色谱柱柱温箱检测器B泵AB时间B浓度分析时间长分离度差MeOH/H2O=4/6MeOH/H2O=8/2等度洗脱95%30%MeOH浓度梯度洗脱梯度洗脱是HPLC的常用手段梯度洗脱装置流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续

5、或间断的改变流动相的组成，以调节它的极性，使样品中每个组分都有较高的分离度，从而实现各组分的圆满分离，梯度洗脱可提高柱效，缩短分析时间，改善检测器的灵敏度，它类似于气相色谱的程序升温技术。4、高效液相色谱法的应用范围高效液相色谱法适于分析沸点高、相对分子质量大，受热易分解的不稳定有机化合物、生物活性物质以及多种天然产物，这些化合物约占全部有机化合物的80%，可应用于化工生产、制药工业、食品工业、生物化工、医学临床检验和环境监测等领域。5、HPLC的系统输液泵相当于人的心脏，不断提供连续、稳定、精确的流量进样器样品引入系统色谱柱关键部分，在

6、这里样品实现分离检测器对分离后的样品进行检测数据记录与处理装置数据分析系统输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统HPLC的系统组成Agilent1100高效液相色谱仪储液瓶真空脱气机混合室自动进样器分离柱VWD手动进样自动进样六通阀进样演示分离系统－色谱柱功能：组分分离目标：分辨力强效率高吸附剂－－－化学键和固定相色谱柱化学键合相色谱柱:70%将不同的官能团通过化学反应键和到硅胶表面的游离羟基上，而形成化学键和固定相，进而形成化学键和相色谱柱。反相:C18,65%;C8,15%;反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。正相:

7、20%;-NH2、-CN其它(手性柱，离子交换柱):10%柱温箱控制温度，保证分析结果重现性升高温度，降低了流动相的黏度，降低柱压，保证色谱系统的稳定性升温对于反相HPLC分离强疏水肽的影响(B27)流动相:A:含0.05%三氟乙酸的水B:含0.05%三氟乙酸的乙腈2%B/min进样量:100µL(50µg的6M脲/5%乙酸)UV:210nm流速:1mL/min室温液相色谱柱:C18色谱柱尺寸:4.6x250mm5µm室温300C400C500C600C700C提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）检测器选择性紫外(VWD、DAD)荧光电化学

8、通用型示差折光蒸发光散射质谱检测系统药典中的液相检测器检测器简介（一）◆紫外吸收检测器（UVD）原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，