流式细胞术基本原理

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1、流式细胞术---原理、操作及应用生物化学与分子细胞生物学系流式实验室地址：西7楼107室电话：63846590-776423教学参考书实用流式细胞术彩色图谱。王树奎、周振英主编。2004.4临床流式细胞分析。王建中主编。上海科学技术出版社。2005.8流式细胞术原理与应用教程。吴后男编。北京大学医学出版社。2008.2实用流式细胞术-血液病篇。刘艳荣主编。北京大学医学出版社。2010.9流式细胞术。陈朱波、曹雪涛编。科学出版社。2010.10主要内容一、流式细胞仪结构和原理流式细胞术简介流式细胞仪的结构组成流式细胞仪的光信号检测流式细胞术数

2、据的存贮、显示与分析流式分选二、流式细胞术操作与技巧三、流式细胞术在生物医学中的应用1.1流式细胞术简介流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。流式细胞仪（FlowCytometer）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞术的特点检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测参数：多参数；检测特点：单细胞水平分析；检测速度：高速，最高达上

3、万个细胞/秒；检测结果：精度高、准确性好；可对目标细胞进行分选；流式：单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准；WB：群体分析，得到多个细胞的平均值。流式细胞仪的发展及商品化1934Moldavanl:Firsttry(固定式细胞分析-流动式)；1953Crosland-Taylor:鞘流系统(解决难题)；1956Coulter原理(血细胞计数器)；1965Kamentsky:分光光度计定量细胞成分和散射光应用；1967Kamentsky等设计了细胞分选的装置；1969Vandilla等:第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)；1972斯坦

4、福大学:研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)；1973BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流式细胞仪-FACSⅠ。1975Kohler和Milstein:单克隆抗体技术(促进流式发展)。1979年国家科委重点项目：研制国内第一台激光流式细胞仪；1982年国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生；1984年国家科委组织科研成果的鉴定验收；1985年获国家卫生部科技成果乙等奖；1985年--1990年灵敏度、信噪比、更多参数；流式分选仪研制开发；计算机四参数软件；样品制备、医学生物学应用。流式细胞仪的分类分析型流式细胞仪细胞样本分析后最终进入

5、废液桶，不能回收利用。分选型流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。BD公司分析型流式细胞仪FACSCalibur双激光四色，市场覆盖率最高LSRII双激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配FACSCantoII双激光六色，三激光八色FACSVerse双激光六色，三激光八色BD公司分选型流式细胞仪FACSVantageSEFACSAriaIIIInfluxBeckmanCoulter流式细胞仪EpicsXL单激光四色，市场覆盖率高，分析型CyAn三激

6、光九色，分析型FC500单激光或双激光五色，市场覆盖率高，分析型Gallios三激光十色，分析型MoFloXDP高端分选型1.2流式细胞仪的结构组成液流系统流动室液流驱动系统光学系统激发光源光束收集系统电子系统光电转换器数据处理系统细胞分选系统喷嘴电偏转板样本收集器1.2.1液流系统鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液(sheath)。流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞

7、重叠进入检测区。鞘液鞘液细胞流激光照射点流体动力学聚焦示意图（一）流动室和液流驱动系统流动室(flowcell,flowchamber)是流式细胞仪的核心部件。流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。进样孔荧光信号激光束鞘液Sheath流动室结构图：单细胞发生器液流驱动系统（二）进样速率控制10psi10.2psi10psi10.8psi通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加，这样会导致变异系数增加。1.2.2光学系统（一）

8、激发光源：激光器气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子(647nm)、氪氩(568nm)；染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodomin6G水溶