博士论文答辩

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1、博士论文答辩草鱼核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-bindingoligomerizationdomain，NOD)基因和γ-干扰素相关基因(IFN-gammarelatedgene，IFN-γrel)的克隆及其表达指导教师：彭克美教授聂品研究员答辩人：陈文钦华中农业大学动物科技-动物医学学院2010年5月30日答辩内容五、课程学习及文章发表情况四、创新点及下步研究计划二、草鱼NOD基因三、草鱼γ-干扰素相关基因一、研究背景汇报内容1.概述以往为人们所熟知的PRRs主要是一些膜结合蛋白

2、如甘露糖受体、To1l样受体、CD14和清道夫受体等，主要识别胞外环境的微生物结构成分。最近的研究发现，胞浆中也存在着识别细菌和病毒成分的PRRs——核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)蛋白。一、研究背景2.NOD蛋白的组成和结构通过对人类基因数据库同源搜索，现已发现20多个成员：NOD1(CARD4)、NOD2(CARD15)、NOD3-NOD5、NALP1-14、IPAF、CIITA、NAIP等。NOD蛋白主要由三个不同的结构域组成：（1）LRR：是富含亮氨酸的重复序列，位于C端（2）NACHT：位

3、于中央，对于NOD蛋白的寡聚体化和活化非常重要。（3）效应结构域：位于N端，可以是1个PYD，1个或2个CARD，或者是3个BIR。一、研究背景NOD家族的结构示意图NALP1NALP2-14NOD1NOD2CARDPYDNACHTNADLRRBIRADFIINDCIITAIPAFNAIPNOD3NOD4XNOD5一、研究背景3.NOD的识别作用已有研究表明，NOD1和NOD2是细胞内细菌肽聚糖的感受器，能识别细菌肽聚糖(PGN)的降解产物。NOD1识别的最小结构是革兰氏阴性细菌的产物内消旋二氨基庚

4、二酸(meso-diaminopimelicacid,meso-DAP)；NOD2识别细菌的最基本结构是PGN的胞壁酰二肽（muramyldipeptide，MDP）。MDP几乎存在于所有细菌的PGN中，因此，NOD2既是G+细菌也是G-细菌的感受器。一、研究背景4.NOD蛋白的信号转导在非活化状态，NOD1、NOD2的LRR和NACHT结合保持分子处于折叠状态。当NOD1和NOD2通过LRR和配体结合后可以打开，通过NACHT自身寡聚，NOD分子的CARD和下游RICK分子的CARD结构域发生嗜同

5、种结合，活化RICK。经过复杂的磷酸化，活化NF-κB，诱导促炎细胞因子的转录以及抗菌肽的合成。一、研究背景NODs介导的信号传导通路图5.NOD蛋白的生物学功能NOD蛋白主要的生物学功能是加强机体免疫系统探测微生物感染的能力，产生IL-1β等促炎因子，调节免疫应答和炎症反应。近来的研究发现NOD蛋白除了识别细菌产物外，还可能诱导细胞凋亡、直接参与细菌感染的控制。现在也有最新报道，证明NOD蛋白也在抗病毒免疫中起着重要作用。一、研究背景6.选题的目的与意义尽管对哺乳动物胞内模式识别受体在参与对细菌的

6、识别、诱导炎症反应的作用等方面进行了深入的研究，但国内外对鱼类NOD基因的研究仅有2篇报道。迄今为止，对鱼类NOD基因的结构，转录和蛋白表达的特征以及是否具有类似于哺乳动物的功能还是不清楚的。本论文拟通过对草鱼NOD1和NOD2基因的克隆以及表达分析，旨在揭示鱼类NOD基因的结构与表达特征。同时该研究为进一步研究NODs基因的功能奠定了基础。一、研究背景二、gcNODs基因的克隆与表达分析1.gcNODs基因的分子特点1.1gcNOD1:cDNA包含3215bp，ORF区域为2813bp，大约编码9

7、37个氨基酸,5′-UTR为350bp，3′-UTR为52bp。C端的LRR结构域，位置在769-791、825-851；N端有一个CARD，结构域在11-73；NOD1的NACHT结构域在186-359。1.2gcNOD2:cDNA全长3130bp，编码982个氨基酸；ORF为2949bp，编码982氨基酸，5′-UTR为81bp，3′-UTR为103bp，C端LRR有7个串联结构域；N端有两个CARD，结构域在27-81、111-200；中间NACHT结构域在271-441。二、gcNODs基因

8、的克隆与表达分析二、gcNODs基因的克隆与表达分析草鱼NOD1草鱼NOD2草鱼NODs基因的结构示意图NACHTCARDLeucineRichRepeat二、gcNODs基因的克隆与表达分析2.gcNODs基因的基因组结构974968171523241319996471895524175180484848484848484124grasscarpNOD11735611271765848484848484319266147108878919090511grasscar