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1、3实验方法和过程儿丁质酶基因定向进化流程图：水稻DNA提取、PCR扩增I回收lOOObp左右片段T载体/连接转化E.coliDH5a感受态细胞涂布Amp平板挑取白色菌落的重组子I提质粒进行单、双酶切和PCR鉴定、序列测定分析I测序结果正确的儿丁质幽基因进行易错PCR双酶切扩增产物和表达载体pET-28a回收并连接CHAB和pET-28a转化感受态细胞涂布含几丁质的Amp平板I筛选突变重组子I提取胞外、胞内儿丁质酶和包涵体包涵体复性及酶活检测3实验方法3.1质粒提取（碱性裂解法）分别挑取CHABAmp平板上长出
2、來的白色菌落接入加有6mLLB、6ylAmp离心管屮，37°C,200rpm摇床培养8h。8h后提取质粒。步骤如下：在超净台工作中取1.5mL菌液到1.5mL离心管中。①8000r/min离心lmin,弃去上清液，是细胞沉淀尽可能干燥。②力［1100
3、il溶液I震荡混合均匀后冰浴lOmino③丿J0200(.11溶液II(ddwater860gk10%SDS100gl5MNaOH40gl)颠倒混匀冰浴Imim(注意溶液II最好现配先用)④力口150(11溶液III颠倒混匀后冰浴5min。⑤12000i7m4°C
4、离心lOmin,取上清加入2倍体积的无水乙醇，室温放置2min。⑥2min后取岀于12000r/m4°C离心15min,弃上清，加入1mL70%乙醇。⑦于12000r/m4°C离心lOmin,弃上清。待沉淀干燥后加30・50卩1TE或无菌水溶解，用枪头轻轻搅匀后取3川进行电泳检测，其余放・20°C保存。3.2易错PCR在引物P1(5'GATGGGATCCGTGAACGGCTACTTGTTCCG3'),和引物P2(5'TGCGGAATTCGTGGTTGGCGACGATCTCC3')的引导下,以含有CHAB基因的质
5、粒pET-28a为模板，体系如下：doom)进行易错PCR扩增。10x易错PCR缓冲液lOplLOxdNTP混合物10pl引物14pl引物24plMgCl220plMnCl23pl质粒DNA模板4plTaqDNA聚合晦0.5plddH2O44.5pl扩增条件：94°C30sec,51°C30sec,72°Clmin,30个循环；72°C10min。其中M『+和Mn"的浓度被调整，可以得到不同频率的文库。3.3PCR产物的检测有口的基因的条带后，按照上述扩增体系进行大量扩増，并用浓度为0.8%的琼脂糖凝胶电泳后四
6、收扩增的冃的基因片段，电泳后切胶并按照刨收试剂盒说明书操作回收冃的片段。冋收步骤：a）紫外灯下将含有日的片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5mL,离心管屮。b）按1:3的比例（凝胶质量毫克数:融胶液体积微升数）加入ExtractionBuffer,（每次加入的ExtractionBuffer最大体积不宜超过1.2mL）。例如,1OOmg凝胶应加入300ExtractionBuffer。c）于55°C水浴孵育lOmin,直到凝胶融化，每2min摇匀一次。d）按1:1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙
7、醇，并混匀。将混合液全部转移到Spincolumn中，于6000rpm离心lmin,弃去接液管内液体（如混合液体体积大于750卩1可先转移750»1,其余的液体待离心管弃液后再转移）。e）向Spincolumn内加500plExtractionBuffer,12000rpm离心30-60s,并弃去接液管内液体。f）向Spincolumn内加650plWashBuffer,12000rpm离心30-60s,并弃去接液管内液体。重复一次。g）再次于12000rpm离心lmin,然旨将Spincolumn转移到无菌的
8、1.5mL离心管屮。h）向Spincolumn中加入30-50（11ElutionBuffer>去离子水或TE溶液，并于室温静置Imino（根据实验的需要决定ElutionBuffer的用量）i）12000卬m离心lmin,1.5mL离心管内溶液中含有冃的基因的DNA片段,取适量的体积（4（11）进行电泳检测，其余放・20°C冰箱保存。3.4突变库的构建将冋收后的几丁质晦突变基因YCHAB和表达载体为pET28a分别进行帼切,体系如下：双IW切（loom）CHAB质粒/pET28a质粒40p1lOxBuffer
9、10plEcoRl5plSall5plH2O40pl37°C水浴1.5h以上。水浴后将酶切产物用浓度为0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并从胶中回收目的基因片段CHAB和pET28ao将回收的口的片段连接，构建重组质粒CHAB-28ao体系（15M）如下:CHAB5plpET28a3pllOxBuffer1.5plLigase1.5plh2o4pl16°C水浴1.5h以上。3.5重组质粒
